NEFA对奶牛中性粒细胞跨乳腺上皮迁移功能的影响

吕观新，王 海，武 瑞 (黑龙江八一农垦大学 动物科技学院 兽医临床诊断与新兽药研发实验室，黑龙江 大庆 163319)

多形核中性粒细胞(poly-morphonuclear neutrophils,PMN)是奶牛体内最丰富的循环粒细胞之一，在奶牛乳腺天然免疫中发挥着重要作用[1]。通常情况下，PMN游离于奶牛外周血中，仅少部分驻存在奶牛组织中。当奶牛发生乳腺感染，病原菌聚集于乳腺腺泡腔内分泌大量炎症因子，此时，PMN将作为应答向炎症部位进行募集。PMN从外周血中募集到炎症部位是一个顺时过程，包括：附着、滚动、黏附和跨上皮迁移[2]。只有当PMN跨过奶牛乳腺上皮进入腺泡腔后，通过吞噬、释放活性氧(ROS)和形成胞外诱捕网(NET)杀灭侵入病原菌，才能保证奶牛乳腺健康[3-5]。

非酯化脂肪酸(non-estesterified fatty acid,NEFA)是一类有机酸，主要由油酸(oleic acid,OA)、棕榈酸(palmitic acid,PA)和硬脂酸(stearic acid,SA)等构成。血清中NEFA的浓度与脂代谢、糖代谢及内分泌功能密切相关[6-7]。足够的能量摄入是奶牛发挥泌乳潜力的重要因素，但泌乳初期的奶牛由于内分泌系统的变化，使自身干物质摄入量下降，导致能量负平衡，此时机体会通过脂肪动员来维持能量代谢平衡。

脂肪动员是指储存在脂肪组织中的脂肪，在一些脂肪酶的作用下逐步水解为NEFA和甘油并释放进入血液，被其他组织利用进行氧化功能的过程[8]。NEFA是机体主要的储备能量，围产期奶牛的高能量需求会进一步促进脂肪动员。此时，奶牛体内大量的NEFA不能被完全氧化分解，进而造成奶牛氧化应激[9]。近年来，NEFA与PMN功能之间的作用关系受到了越来越多的关注。CROOKENDEN等[10]对高NEFA浓度奶牛中分离出的PMN进行转录组测序后发现粒细胞募集、干扰素信号传导和细胞凋亡有关的基因下调，表明发生代谢应激的围产期奶牛PMN功能受损，奶牛体内NEFA浓度过高会对先天免疫系统产生负面影响，并可能导致围产期奶牛免疫抑制状态的发生。HAMMON等[11]在研究围产期奶牛外周血PMN功能、能量状态和子宫健康之间的关系时发现，血液中NEFA含量显著升高和干物质采食量下降后，能量负平衡奶牛的PMN杀菌能力显著受损。ZERBE等[12]在研究肝脏甘油三酯含量与PMN功能关系时发现，从甘油三酯含量高的奶牛中分离出的PMN趋化和吞噬功能受损，呼吸暴发产生的ROS量也显著下降，这可能有助于解释能量负平衡奶牛子宫内膜炎的患病率更高的原因。CARRILLO等[13]研究发现OA可以诱导人PMN活化并通过钙信号介导ROS产生。

综上所述，围产期奶牛持续加剧的能量负平衡状态使奶牛体内NEFA浓度不断升高，对PMN功能产生不利影响，这可能是围产期奶牛更易患传染性疾病如乳腺炎、子宫内膜炎等疾病的原因。目前对于NEFA和PMN迁移功能方面的研究较少。因此，本研究拟通过体外构建Transwell跨乳腺上皮迁移模型，并以此模型研究不同浓度的OA、PA及SA对PMN迁移功能的影响，为通过奶牛天然免疫系统防控奶牛乳腺炎提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物自黑龙江省安达市某规模化牧场随机选取健康且处于泌乳期的奶牛。

1.2 主要试剂DMEM/F12培养基、RPMI 1640培养基和胎牛血清(FBS)购自Gibco公司；Transwell 24孔通透性嵌套(3.0 μm)和胶原蛋白(Collagen Ⅰ)购自Corning公司；PMN趋化肽N-Formyl-Met-Leu-Phe(fMLP)购自Sigma公司；牛外周血中性粒细胞分离Kit购自天津灏洋生物制品科技有限责任公司；胰蛋白酶、DMSO和Hank's缓冲液购自北京索莱宝科技有限公司；硬脂酸钠溶液、油酸钠溶液和棕榈酸钠溶液购自西安鲲创科技发展有限公司。

1.3 Transwell跨乳腺上皮迁移模型构建MAC-T细胞由本实验室培养与冻存。将MAC-T细胞从液氮中取出，37℃水浴解冻。吸取细胞液至15 mL离心管中并加入等体积的DMEM/F12完全培养基(含10% FBS，青霉素/链霉素100 mg/L)，1 500 r/min离心3 min，收集沉淀。加入DMEM/F12完全培养基重悬混匀细胞，以1×106/mL接种于25 cm2细胞培养瓶中，补充完全培养基至5 mL，于37℃、5% CO2培养箱中培养。待细胞长至培养瓶底达90%时，弃去瓶内培养基，用PBS洗涤2～3次，加入2 mL 0.25%胰酶，室温或置于细胞培养箱内37℃消化。待镜下观察细胞变圆且有部分脱落时，加入4 mL完全培养基终止消化，按1∶2传代培养；用乙酸(0.006 mol/L)将Collagen Ⅰ稀释至0.012 mg/L，将Transwell嵌套倒置于无菌培养皿上，将稀释好的Collagen Ⅰ均匀铺在面积为0.33 cm2的Transwell嵌套底膜后，将培养皿置于生物安全柜中静置过夜风干。将先前培养生长状况良好的MAC-T(1×105个)接种于包被有Collagen Ⅰ的Transwell嵌套底膜，于37℃、5% CO2培养箱中6 h，取出平皿用Hank's液冲洗嵌套底面去除未贴壁细胞；用无菌镊子将Transwell嵌套正置放入24孔板中，向Transwell嵌套中加入200 μL完全培养基，对应孔中加入500 μL完全培养基，于37℃、5% CO2培养箱中培养。待镜下观察细胞生长至底膜达90%时，将嵌套取出并用Hank's液冲洗2～3次后移回24孔板。

1.4 PMN分离与鉴定随机挑选奶牛进行尾根静脉采血至含枸橼酸钠的一次性负压采血管中。备好15 mL离心管，做好标记，每管先加入4 mL PMN分离试剂A，后加入2 mL PMN分离试剂C；吸取1 mL 外周血缓慢加于分离液C上层，2 500 r/min离心30 min；取新离心管，将第2层乳白色环状细胞层吸出到新离心管中，再加入适量红细胞裂解液1 500 r/min离心10 min，重复1～2次直至无红细胞残留；弃上清用Hank's液洗涤2～3次，1 500 r/min 离心10 min，最后底部沉淀用1 mL RPMI 1640完全培养基重悬混匀，用Trypan blue染色后用于PMN活性鉴定，并用Countess细胞计数仪进行细胞计数；用DAPI染色后用荧光显微镜进行PMN纯度鉴定。

1.5 NEFA对PMN跨奶牛乳腺上皮细胞迁移功能的影响用DMSO将PMN趋化肽fMLP稀释至10 μmol/L，再将油酸钠溶液、棕榈酸钠溶液和硬脂酸钠溶液用去离子水稀释，使油酸钠溶液使用浓度分别为0.130，0.260，0.520 mmol/L，棕榈酸钠溶液使用浓度分别为0.1，0.2，0.4 mmol/L，硬脂酸钠溶液使用浓度分别为0.04，0.08，0.16 mmol/L。取12个Transwell嵌套至24孔板中，每12孔为一组，其中前6孔作为空白对照组，其余6孔作为不同浓度的NEFA组分的试验组，每组重复检测3次。向每个嵌套中依次加入100 μL PMN(1×105个)，并向空白对照组嵌套加入100 μL RPMI 1640完全培养基，试验组嵌套加入100 μL各使用浓度的NEFA组分。依次向嵌套对应孔中加入990 μL RPMI 1640完全培养基及10 μL fMLP(10 μmol/L)，使孔中fMLP终浓度为100 nmol/L。将放有Transwell嵌套的24孔板置于37℃、5% CO2培养箱中孵育2 h。将24孔板取出并移除Transwell嵌套，将孔中液体反复吹打混匀后，每孔收集300 μL液体到流式专用管中，用流式细胞仪进行计数。

2 结果

2.1 Transwell跨乳腺上皮迁移模型构建对MAC-T进行复苏培养，显微镜下观察可见细胞均匀分布于培养瓶中，部分开始贴壁生长(图1A)；继续培养至48 h，可见培养瓶底面呈典型上皮细胞样的细胞，生长面积达95%以上(图1B)；在Transwell嵌套底面接种MAC-T，6 h后可见大部分MAC-T已贴壁生长(图1C)；继续培养至48 h时，观察底面可见MAC-T生长状况良好，已覆满整个底面，可用于后续试验(图1D)。

A.刚复苏的MAC-T细胞；B.贴壁后的MAC-T细胞；C.接种MAC-T细胞 6 h；D.接种MAC-T细胞 48 h图1 MAC-T细胞在Transwell嵌套底膜的培养(100×)

2.2 PMN活性及纯度鉴定结果如图2所示，PMN存活率大于95%，纯度大于90%，满足后续试验要求。

图2 PMN活性及纯度鉴定

2.3 NEFA对PMN跨奶牛乳腺上皮细胞迁移功能的影响用不同浓度PA、SA和OA分别刺激PMN后，分别收集对应孔300 μL液体到流式专用管中，用流式细胞仪进行计数。结果显示，PA和SA对PMN跨乳腺上皮迁移数量并无显著影响(P>0.05)(图3A、B)；但不同浓度的OA可显著促进PMN跨乳腺上皮迁移数量(P< 0.01)，其作用特点呈剂量依赖效应(图3C)。结果表明，NEFA的不同组分对PMN跨乳腺上皮迁移能力具有不同影响，其中，OA可以呈剂量依赖形式，促进PMN跨乳腺上皮迁移。

*表示与空白对照组差异显著(P<0.05)；**表示与空白对照差异极显著(P<0.01)；无*表示与空白对照组差异不显著图3 PA、SA及OA对PMN跨奶牛乳腺上皮迁移功能的影响

3 讨论

健康奶牛体内NEFA浓度不高于0.4 mmol/L，泌乳初期的奶牛通过干物质采食所摄取的能量不能满足全部能量需求，机体需要通过脂肪动员来维持能量代谢平衡[14]。围产期奶牛的高能量需求会进一步促进脂肪动员，奶牛体内大量的NEFA不能被完全氧化分解，进而造成奶牛氧化应激[15]。有研究表明，NEFA的不完全氧化是导致围产期奶牛免疫功能降低，患病风险升高的关键因素之一[16]。以往NEFA与PMN功能的研究集中在PMN趋化性、吞噬功能和ROS产生方面，而尤为重要的PMN迁移功能方面的研究较少[10-12]。

因此，本试验构建Transwell跨乳腺上皮迁移模型，体外研究了不同浓度的OA、PA及SA对PMN迁移功能的影响。结果表明，PA和SA对PMN跨乳腺上皮迁移功能并无显著影响，各浓度OA对PMN迁移功能均具有极显著的促进作用，造成这种现象的原因可能是PMN表面存在游离酸脂肪受体-1(GPR40)，OA可通过GPR40并以剂量依赖方式调节PMN细胞内的钙动员，并以此增强了PMN迁移功能[17]。有研究表明，OA可通过活化蛋白激酶ERK信号通路促进Ca2+内流，Ca2+的升高直接影响F-肌动蛋白骨架重塑以及迁移过程中的整联蛋白信号级联传导，从而促进PMN迁移功能[18-19]。综上所述，NEFA不同组分对奶牛PMN迁移功能具有不同的影响，OA可以促进PMN跨乳腺上皮迁移能力，提示通过改善饲料成份和配比，提高OA在奶牛体内NEFA中的占比，可能有助于防治奶牛乳腺炎。