5个绵羊群体ESR2基因多态性与产羔数的关联分析

邵顺成，闫背背，张天闻，梁 鹏，邹诗凡，李新海，冯登侦 (宁夏大学 农学院，宁夏 银川 750000)

我国绵羊品种丰富，但多羔品系较少，为了适应现代养羊业生产的需求，必须要有完整的良种繁育体系，利用现代生物技术手段，提高品种的利用价值。传统育种方法获得遗传进展的速度缓慢，而利用标记性辅助选择可以进行早期选种，从而提高选择强度及效率。利用分子标记手段对绵羊进行选育，培育出多羔和具有优良生产性能的绵羊品种(系)的任务仍十分必要。

雌激素是动物体内重要的激素之一，参与了免疫、神经、内分泌和心血管等系统的功能调节，有多种生理作用，但要结合相应的受体才能发挥其生物学作用。雌激素受体(estrogen receptor,ESR)属转录因子核受体超家族成员，主要由经典的ESR1、ESR2以及新型的G蛋白耦联雌激素受体1(GPER1)组成。ESR1又叫ERα，其通过与雌激素结合，形成配体迁移至细胞核，结合特定的反应元件来调控转录过程，从而在相应的靶组织表达调控[1]。ESR2基因首次在大鼠的前列腺组织中发现，主要在前列腺的上皮细胞和卵巢颗粒细胞中表达， ESR2蛋白与ESR1蛋白DNA结构域同源性为95%，配体结合域同源性为55%，因具有高度的同源性，故将该蛋白命名为ERβ[2]。绵羊ESR2基因位于7号染色体，共编码527个氨基酸，属于非跨膜蛋白，广泛表达于全身各组织，如：子宫、卵巢、结肠、前列腺、肺和膀胱等[3]。研究发现ESR2基因在卵泡形成和排卵中起关键作用，若敲除小鼠ESR2基因外显子4区域，可抑制小鼠排卵，原因是外显子4区域含有DNA结合域，DNA结合域对卵泡成熟和排卵有着至关重要的作用[4]。研究表明，ESR2基因可以调控动物的繁殖性状，如ESR2在家禽卵巢中表达量与产蛋性能有一定的关联性[5-6]；同时ESR2基因也被证实是调控猪高产仔数的基因之一[7-8]。近年来，国内外学者研究发现，ESR2基因也是影响绵羊多产的候选基因之一，使用ESR2进行标记辅助选择可增加绵羊的产仔数，对养羊业具有重要的经济价值[9]。

本试验以杜泊羊、滩寒羊、杂一代、杂二代和横交一代5个绵羊群体为研究对象，基于Ensembl数据库中已有的ESR2基因的错义突变位点，通过 Sequenom Mass ARRAY®SNP 技术对5个绵羊群体ESR2基因g.73323973C>T、g.73326795G>A和g.73353489C>A 3个位点进行检测，并进行产羔数关联分析；利用相关生物信息学工具对突变前后二级结构和蛋白互作等进行分析与预测，以期为进一步研究绵羊ESR2基因的生物学功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料共采集5个绵羊群体共768只绵羊的血样，其中有产羔数记录的599只(表1)，各群体血缘比例关系见表2。受试羊群均为母羊，购自宁夏宇泊科技有限公司。所有羊只进行颈静脉采血5 mL，加入EDTA-K2抗凝真空采血管 (江苏宇力医疗器械有限公司)中，-20℃保存。同时记录各群体母羊的产羔季节、胎次与产羔数。

表1 试验羊群信息

表2 各群体血缘比例关系

1.2 绵羊基因组DNA提取使用血液DNA提取试剂盒(北京天根科技有限公司)对绵羊血液样本DNA进行提取，使用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量，利用NanoDrop 2000超微量分光光度计和0.8%琼脂糖凝胶电泳检测5个绵羊群体血液DNA的纯度、浓度和完整性。

1.3 基因分型采用Mass ARRAY Assay Design 3.1软件设计检测ESR2基因3个位点的单碱基延伸引物和聚合酶链式反应程序。

1.5 生物信息学分析通过SOPMA工具(http://npsaprabi.ibcp.fr/NPSA/npsa_sopma.html)分析ESR2蛋白的二级结构；运用STRING数据库(http://string-db.org/)，设置为高置信度0.7，构建与绵羊ESR2蛋白相互作用的蛋白质网络。

2 结果

2.1 ESR2基因3个位点在5个群体中的分型结果由图1可见，ESR2基因g.73323973C>T位点在D、F1、F2、H1、TH 5个群体中有CC、TC和TT 3种基因型；g.73353489C>A位点在D、F1、F2、H1、TH 5个群体中有CC、CA和AA 3种基因型；g.73326795G>A位点在5个群体中有AA、GA和GG 3种基因型。

g.73323973C>T g.73326795G>A g.73353489C>A图1 ESR2基因3个位点在5个群体中的分型结果

2.2 5个群体ESR2基因不同位点的基因多态性分析ESR2基因g.73323973C>T位点在5个群体中均表现为中度多态；该位点在5个群体中的优势等位基因为C，除在D群体中的优势基因型为TC，在其他4个群体中的优势基因型为CC；各群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态。g.73353489C>A位点在5个群体中均表现为中度多态；各群体优势等位基因均为C，优势基因型为CC；该位点除D羊群体外，在其他4个群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态。g.73326795G>A位点在TH群体中表现为低度多态，在D、F1、F2、H1群体中表现为中度多态；该位点在5个群体中的优势等位基因为A，除在D群体中的优势基因型为AG，在其他4个群体中的优势基因型为AA；各群体均处于Hardy-Weinberg平衡状态。

2.3 ESR2基因3个位点各基因型与5个绵羊群体产羔数的关系对ESR2基因3个位点的不同基因型与5个群体产羔数进行关联分析，结果表明，g.73323973C>T位点在TH群体中与产羔数有一定的关联性，其中TT型产羔数显著高于TC、CC型(P<0.01)，说明g.73323973C>T位点适用于TH群体多羔性状的选育。g.73326795G>A、g.73353489C>A 2个位点各基因型之间产羔数差异均不显著，不适用于5个绵羊群体多羔性状的选育，详情见表4。

表3 ESR2基因3个位点在5个群体中的群体遗传结构分析

表4 ESR2基因不同位点各基因型产羔数的关联分析

2.4 生物信息学分析

2.4.1绵羊ESR2基因编码蛋白二级结构的分析 用SOPMA在线工具预测其二级结构，结果表明参考蛋白二级结构α-螺旋(alpha helix)占35.29%，无规卷曲(random coil)占53.13%，延伸链(extended strand)占8.16%，β-转角(beta turn)占3.42%。而位点g.73323973C>T、g.73326795G>A和g.73353489C>A 3个位点的突变导致ESR2蛋白的 α-螺旋、β-转角、无规卷曲和延伸链均发生了改变。

表5 蛋白质突变前后二级结构预测分析 %

2.4.2绵羊ESR2蛋白相互作用 运用STRING数据库(http://string-db.org/)，设置为高信度0.7，构建与绵羊ESR2蛋白相互作用的蛋白网络(图2)。结果显示，与ESR2蛋白相互作用的蛋白主要为NCOA家族、MAPA家族、SP1、NCOR1、SRC等相关蛋白。

图2 绵羊ESR2蛋白的互作图

3 讨论

雌激素受体是配体依赖的转录调节因子，属于配体激活转录因子中的一种核酸受体，不仅参与动物的繁殖性状，研究发现雌激素受体还参与相关病理活动，如心血管疾病、癌症等，故在诊疗技术方面的研究有很大的潜力[10-11]。ANTONSON等[12]通过基因编辑技术敲除了小鼠ESR2基因，发现缺乏ESR2基因的母鼠繁殖率较低，并且可导致后代不育。同时发现ESR2基因完全丧失会导致母鼠卵巢变小，使卵泡的成熟及排卵均受到影响[13]。研究发现雌激素受体在牛卵泡颗粒细胞中表达水平随着卵泡的发育，其表达量逐渐降低，故ESR2基因可能对牛的卵泡发育与排卵起重要作用[14]。国内外学者对猪ESR2基因研究颇多，发现ESR2基因是影响猪产仔的主效基因之一，高天等[15]发现ESR2基因的外显子1的A221G位点与嘉兴黑母猪的产活仔数、总产仔数、初生均重以及死胎数显著相关，为筛选母猪种群的高繁殖基因提供重要分子标记。自Fecb基因已被证实可以提高绵羊的产羔数，为绵羊分子育种提供了重要分子标记手段，所以继续发掘与绵羊多羔相关的主效基因是国内外学者研究的热点。ESR2基因作为影响动物繁殖性状的基因之一，在绵羊上的研究也逐渐增多，如田志龙等[16]发现ESR2基因g.73324006C>T位点多态性与小尾寒羊前3胎产羔数及平均产羔数均显著关联，其中CC基因型各胎产羔数均高于TC基因型，并且ESR2基因在单羔小尾寒羊的垂体表达量显著高于多羔小尾寒羊的垂体。

本研究团队初期对滩羊、小尾寒羊、杜泊羊和滩寒羊为研究对象，利用飞行质谱法技术对ESR2基因10个错义突变位点进行分型检测，探究不同品种绵羊ESR2基因的遗传结构，以期筛选出影响绵羊高繁殖力的关键位点，为绵羊选育提供分子标记。结果显示g.73323973C>T与g.73326795G>A位点在杜泊、小尾寒羊和滩寒羊中A基因频率极显著高于滩羊(P<0.01)，所以这2个位点可能是影响绵羊产多羔的候选位点；g.73353489C>A位点的T基因频率在杜泊羊群体极显著高于小尾寒羊、滩羊、滩寒羊(P<0.01)，可作为杜泊羊繁殖性状选择的候选基因[17]。基于此，本试验以5个绵羊群体为研究对象，对ESR2基因的3个多态位点展开研究，发现其同样具有多态性。表型数据的关联对分子标记育种起着至关重要的作用，产羔数关联分析发现g.73323973C>T位点在滩寒羊群体中，TT基因型产羔数极显著高于TC和CC基因型(P<0.01)，表明g.73323973C>T位点突变后可能会引起滩寒母羊排卵数增加。同时在H1群体中发现，该位点突变后，TT基因型产羔数均高于TC和CC基因型产羔数，但因H1群体TT基因型母羊样本量较少，故后期要增加样本量，再次进行关联分析。

本研究的3个位点都属于错义突变位点，其突变前后均会引起氨基酸的改变。生物信息学分析发现3个位点突变前后蛋白质的二级结构类型均发生了变化，结构的变化导致功能的变化。其中3个位点突变后均导致α-螺旋比例降低，使其稳定性降低。蛋白互作网络发现该基因编码的蛋白主要与核受体辅激活蛋白 (nuclear receptor coactivator,NCOA)、丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)等蛋白互作。其中NCOA蛋白又称为类固醇受体辅激活蛋白，可以调节多种转录因子的活性，会影响黄体的生成，NCOA1基因也被证实为动物繁殖性能候选基因之一[18-19]。从蛋白互作发现ESR2蛋白与多种信号通路中蛋白进行互作，参与多种生理调控，但其互作网络调控作用的相关机制有待深入研究。本研究为进一步探讨将ESR2基因应用到多羔绵羊品系的培育中提供相关遗传信息基础。