非洲猪瘟病毒与天然免疫系统相互作用研究进展

屈海龙，戈胜强，张永强，韩乃君，孙成友，吴晓东，王志亮 (中国动物卫生与流行病学中心，山东 青岛 266032)

非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种出血性猪病毒性疾病，可以感染野猪和家猪。强毒株感染的致死率可达100%，毒性较低的毒株可导致亚临床症状，甚至是慢性感染。该疾病的急性形式以发烧、食欲不振、嗜睡和出血为特征[1]。由于ASF的破坏性影响，该疾病被列入世界动物卫生组织(OIE)必须报告的疾病。

ASFV是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，属于核质巨DNA病毒(nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDV)[2]。最早在1921年，ASFV在肯尼亚作为一种地方性病毒被首次发现[3]。自此，ASF在许多撒哈拉以南国家流行。20世纪中叶扩散到欧洲，后来又扩散到南美洲和加勒比地区。20世纪90年代，欧洲(撒丁岛除外)通过严格的生物安全计划和措施控制并净化了ASF。但仅仅控制了10年，在2007年，ASFV通过格鲁吉亚重新进入欧洲，并迅速蔓延到俄罗斯等东欧等国家[4-6]。2014年，ASFV 首次传入欧洲联盟(EU)国家[7]。2018年8月，我国暴发首起ASF疫情，截止到2021年7月，我国31个省、市、自治区、直辖市共计暴发187起ASF疫情，给养猪业带来了灾难性的影响，严重影响了我国畜牧业经济的发展。由于ASFV复杂的生物学特性以及感染引起的宿主免疫反应机制还不完全清楚[8]，目前还没有针对ASF的商业化疫苗和抗病毒药物[9]。但是，研究人员在抗ASFV免疫和开发ASF候选疫苗方面做了大量的工作[10]，给未来疫苗及抗病毒药物的研发带来了希望。

天然免疫系统是抵御所有感染的第1道防线，是特异性免疫反应的前哨[11]。ASFV可以感染脊椎动物(家猪和野猪)，也可以感染无脊椎动物(软蜱)，而这2个宿主只有天然免疫反应是共同的，因此可以合理地推测ASFV已经进化出操纵宿主天然免疫系统的基因，以维持自身对宿主的持续感染[12]。近年来，随着不断深入研究，ASFV感染与宿主天然免疫系统的关系不断被揭示，现就ASFV感染与宿主天然免疫应答及其免疫抑制机理研究的进展进行综述，希望能为ASF的防控提供参考。

1 ASFV概述

ASFV是一种线性的有囊膜的双链DNA病毒，完整的病毒颗粒有5层结构，总体上呈二十面体形态，直径大小为260～300 nm[2,13]。ASFV具有线性双链DNA基因组，大小为170～194 kb，可编码150～170个开放阅读框(ORF)，其中近一半基因的功能尚不清楚[14-15]。ASFV颗粒包含50多种蛋白[13,16]，并可在感染细胞中产生150多种蛋白质[14,17]。ASFV的主要靶细胞是猪的单核细胞/巨噬细胞[18-19]，也可在其他类型细胞中复制，包括肝细胞、肾小管上皮细胞、中性粒细胞和内皮细胞[20-22]。根据ASFV B646L基因C末端核酸序列的差异和红细胞吸附抑制实验，将ASFV分成了24个基因型8个血清群[14,23]，引起我国暴发首起ASF疫情的毒株属于基因Ⅱ型血清8群[24]。

2 ASFV与干扰素

干扰素是由多种细胞产生的具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白，分为Ⅰ型干扰素和Ⅱ型干扰素，是天然免疫的重要组成部分。Ⅰ型干扰素具有广谱的抗病毒活性，Ⅱ型干扰素具有较强的免疫调节作用。干扰素能抑制病毒在细胞内的传播和早期感染细胞的细胞间传播，从而抑制病毒在感染细胞中的复制[11]。

2.1 ASFV抗宿主Ⅰ型干扰素反应病毒通常通过病原体相关分子模式(PAMP)，被细胞表面或细胞质中的细胞模式识别受体(PRR)识别。先天性免疫反应在感受到PAMP时被触发，诱导Ⅰ型干扰素表达[25-26]。ASFV作为细胞质DNA病毒，DNA的感应途径可能是感应感染和诱导Ⅰ型干扰素的关键。目前，尚不清楚在ASFV感染巨噬细胞时PAMP和PRR的具体机制[8]。

先前的研究表明，ASFV编码的MGF360和MGF505(也称为MGF530)通过抑制宿主细胞干扰素表达，达到抑制病毒胞内复制的目的[27]。Pr4Δ35为缺失8个MGF360和MGF505基因的重组毒株，可在体外诱导猪巨噬细胞产生IFN-α，而亲本Pr4株则不会。在用2 000 IU/mL重组IFN-α处理肺泡巨噬细胞后，Pr4Δ35的复制显著减少。相比之下，亲代Pr4病毒的复制则不受IFN-α的抑制[27-28]。IFN-α不会影响强毒ASFV(BA71、Georgia 2007/1、OUR T88/1)在肺泡巨噬细胞中复制的能力。但是，通过用2 000 IU/mL重组IFN-α预处理细胞，OUR T88/3的复制减少了约90%[28]。作为MGF360的成员，A276R基因不仅通过靶向干扰素调节因子3(IRF3)抑制其活化，从而抑制IFN-β表达，而且还能抑制核转录因子κB(NF-κB)活化，但抑制NF-κB活化与抑制IFN-β表达没有关联[12,29]。MGF360-12L可以通过阻断核转运蛋白输入蛋白(importin α)和NF-κB信号通路的相互作用来抑制Ⅰ型IFN的产生[30]。MGF505-7R(A528R)通过同时抑制IRF3和NF-κB转录因子来抑制Ⅰ型IFN的诱导，该蛋白还抑制Ⅰ型和Ⅱ型干扰素信号通路[12]。MGF505-7R缺失的ASFV比野生型ASFV在体外诱导更多的IFN-β产生，并且其在体外复制能力减弱[31]。从ASFV强毒株中删除不同数量的MGF360和MGF505基因，构建的重组ASFV表现出明显的毒力降低，并且能够诱导宿主免疫保护反应，保护宿主免受强毒株的攻击[32-34]。ASFV的I329L蛋白与细胞膜上高度糖基化的Toll样受体3(TLR3)十分相似，能够抑制宿主天然免疫系统中的2个重要因子NF-κB和IRF3的激活，从而抑制宿主IFN-β表达[12,35]。ASFV在细胞水平上抑制Ⅰ型干扰素表达，但是研究人员发现被ASFV强毒株感染的猪血清中存在有活性的干扰素，并且同时检测到IFN-α和IFN-β[28,36]，这说明干扰素的表达在体内和体外还是有区别的，需要进一步研究。

2.2 ASFV抗宿主Ⅱ型干扰素反应Ⅱ型干扰素又称干扰素γ(IFN-γ)，主要由活化的T细胞、NK细胞产生。由于ASFV主要的靶细胞是单核/巨噬细胞，IFN-γ可能对ASFV与宿主细胞的相互作用产生直接影响，特别是在病毒感染的早期阶段。早在1988年，有文献报道，猪IFN-γ能在体外猪巨噬细胞中抑制ASFV的复制[37]。REVILLA等[38]用无毒的ASFV注射免疫近交系猪，然后分离外周血单核细胞(PBMC)，发现只有用同源或减毒的ASFV(Ba71v、Ba71、UGA 59)刺激时，才能产生IFN-γ，而用异源、强毒的ASFV(CC83、WH55)刺激时则不能产生。接种无毒的ASFV OURT88/3后再接种强毒OURT88/1猪的每百万PBMC中能产生IFN-γ的淋巴细胞数量要比单独接种OURT88/3的多，并且与免疫保护有良好的相关性[39]。随后通过交叉保护试验证明，当免疫后猪的PBMC用其他基因Ⅰ型毒株(Benin 97/1)刺激时，可以检测到高水平IFN-γ，Lisbon 57则不产生；而用基因Ⅹ型乌干达分离株刺激时则产生很高水平IFN-γ。通过免疫保护试验发现，所有能够产生IFN-γ的免疫猪能够抵抗乌干达强毒分离株的感染[39]。这些结果表明，IFN-γ与ASFV的免疫保护有很好的相关性。

3 ASFV与细胞凋亡

细胞凋亡是宿主抵抗病原体的重要防御机制，具有限制病原体复制和传播的作用，是天然免疫的重要组成部分。许多病毒已经进化出多种抗细胞凋亡机制。ASFV编码多种抗宿主细胞凋亡的蛋白，可抑制感染细胞的凋亡。

ASFV的A179L蛋白是一种B细胞淋巴瘤2样蛋白(Bcl-2)，包含与BH3蛋白家族结构域相似的所有结构域，可以抑制Bax和Bak的激活，进而通过抑制细胞色素C的释放和凋亡酶激活因子1(APAF1)/细胞色素C复合物的形成以及Caspase级联反应的激活，从而抑制宿主细胞凋亡[40-41]。A179L蛋白在ASFV感染细胞后的早期和晚期都表达，但没有包装到病毒颗粒中。这表明A179L可能在整个感染过程中均参与抑制细胞凋亡，但并未参与病毒核心进入细胞质的最早阶段[13,42]。

ASFV的A224L蛋白是凋亡抑制蛋白(IAP)家族的成员，并含有BIR基序。在感染了删除A224L基因的ASFV的细胞中，观察到Caspase 3活性增加，说明A224L可抑制Caspase 3的激活，从而抑制细胞凋亡。A224L的表达可激活NF-κB，通过激活许多抗凋亡基因(包括IAP和Bcl-2家族成员)的转录抑制细胞凋亡。A224 L蛋白是ASFV晚期表达蛋白，被包装到病毒颗粒中，在病毒感染的前期和后期均具有潜在作用[43-44]。与亲本株相比，删除A224L基因的ASFV强毒株在猪巨噬细胞中的复制并没有变化，毒力也没有降低[45]，NH/P68Δ224L-COS7却能提供一定强毒攻击保护，虽然在感染后期，实验动物出现了胃、肝、肾、淋巴结中度肿大和部分出血，心包积水等亚临床症状[29]。说明ASFV在体内抑制宿主细胞凋亡并不是通过单一蛋白完成，可通过其他多个基因协作弥补A224L的缺失。

ASFV的DP71L蛋白可以靶向性地使真核翻译起始因子2α(eIF-2α)去磷酸化，抑制促凋亡转录因子CHOP的激活，从而抑制内质网应激介导的细胞凋亡[46-47]。分别删除ASFV Malawi Lil20/1和 ASFV E70中DP71L基因，然后用重组毒感染猪巨噬细胞，发现不会引起细胞eIF2α磷酸化水平的增加或CHOP的诱导，这表明DP71L不是ASFV在感染过程中控制eIF2α磷酸化水平所需的唯一基因[47]。DP71L可能不是某些ASFV毒力所需，分别从ASFV Malawi Lil20/1和ASFV Pretoriuskop/96/4中删除全长的DP71L和截短DP71L基因，对家猪的毒力没有影响[48]。相反，从ASFV E70中缺失或截短DP71L基因可导致毒力减弱[49]。这可能是ASFV E70自然缺失了其他一些基因，而这些基因可以补偿DP71L的缺失所造成的影响。

ASFV可通过多种机制抑制感染细胞的凋亡，但是在感染的后期可以观察到被感染细胞的凋亡。通过这种方式促进病毒在凋亡小体中的扩散和单核细胞/巨噬细胞吞噬病毒，从而避免被感染细胞的坏死引起的炎症反应。在体内也可观察到受感染的单核细胞/巨噬细胞的凋亡。急性ASF的主要特征是引起淋巴组织和血液中未受病毒感染的B、T淋巴细胞大量凋亡。初级和次级淋巴器官中的淋巴细胞消耗以及非淋巴器官(例如肝和肾)中淋巴细胞的死亡均归因于淋巴细胞的大量凋亡，但是诱导未感染淋巴细胞凋亡的机制还不清楚[50-52]。被感染的巨噬细胞周围淋巴细胞强烈凋亡，这表明被感染的细胞可能分泌或细胞表面表达某些因子，从而诱导未感染的淋巴细胞凋亡，TNF-α就是一种可能的参与因子[18,53]。由凋亡引起的淋巴细胞的大量死亡可能也是免疫抑制的一种机制，有利于ASFV在体内复制。

4 ASFV与炎症反应

ASFV可以抑制巨噬细胞M1极化，抑制机体炎症反应。研究人员通过比较蛋白质组学研究发现，弱毒株E75CV1调节了涉及宿主炎症反应的多个蛋白的表达[54]。ASFV的A238L蛋白与NF-κB转录因子的抑制物I-κB具有相似的结构，因此A238L蛋白可以抑制NF-κB的活化，从而抑制NF-κB信号通路诱导的炎症反应[55]。A238L蛋白还能够结合钙调蛋白磷酸脂酶(CaN)并抑制其作用，从而抑制了活化T细胞核因子(NFAT)活化[20]，进而抑制宿主的炎症反应[56]。A238L在感染了ASFV的Vero细胞或巨噬细胞中可有效地抑制TNF-α的产生，说明A238L蛋白是一种强效的抗炎蛋白[57-58]。研究人员应用酵母双杂交试验发现，ASFV的I83L蛋白能与IL-1β结合，并且预测I83L蛋白可能在调控IL-1β促炎活性方面起作用[59]。

5 ASFV与天然免疫细胞

自然杀伤细胞(NK cell)是先天免疫系统的重要细胞组成成分，能够杀死感染了病原体的细胞和恶性肿瘤细胞，是IFN-γ和TNF-α的重要来源[60]。研究人员将感染ASFV NH/P68的猪与未感染的对照组相比，发现感染后7 d猪的NK细胞活性明显增加，而在感染后7～28 d，没有临床症状的接毒猪NK细胞水平显著性增高。试验中无临床症状的猪能够经得住ASFV Lisbon 60致死性攻击。这一结果表明，NK细胞的激活能够减轻ASFV分离株引起的临床症状，有效诱导保护性免疫[61]。相反，接种中等毒力Malta 78 ASFV分离株的6头猪中，有4头猪在接毒后3～6 d NK细胞活性出现明显抑制[62]。令人感兴趣的是，研究人员发现，在体外40℃培养时，NK细胞活性丧失，因此，猪患ASF后，体温升高可能是NK细胞活性降低的原因。另一方面， ASFV在体外可以抑制NK细胞的活性[63]。NK细胞的活性有可能与ASFV的毒力相关，因为从健康猪体内分离的外周血淋巴细胞(PBMC)中的NK细胞活性可被无毒的NH/P68 ASFV激活，但被有毒的Lisbon 60 ASFV抑制[64]。综上所述，NK细胞至少能够对非致病性ASFV做出有效地反应。

ASFV主要的靶细胞是单核细胞/巨噬细胞，但也可以感染树突状细胞(DC)等抗原呈递细胞并在其中复制。有研究表明，将猪的γδ T细胞与ASFV共同孵育后，γδT细胞可将ASFV递呈给特异性T细胞[65]。猪γδT细胞可以分泌IFN-γ等细胞因子和趋化因子，可能在ASFV感染过程中发挥作用，但其具体机制还需要进一步研究[65]。

6 小结与展望

ASF对于家猪和野猪是一种毁灭性的疾病，目前还没有商用疫苗预防该病。虽然在ASFV与宿主的相互作用以及逃避宿主免疫反应研究方面已经取得了一定进展，但仍有许多问题需要深入研究。关于树突状细胞感染在发病和免疫反应中的潜在作用，目前尚缺乏资料。非易感细胞的感染障碍也不清楚。ASFV蛋白质组图谱绘制成功后，为进一步研究病毒和宿主相互作用奠定了基础，这将为研发疫苗或发展其他控制感染策略提供更多的帮助。

ASFV与宿主天然免疫系统的相互作用过程相当复杂，随着研究的深入，人们对宿主抗ASFV机理和ASFV如何逃避宿主天然免疫系统防御有了一些认识，但宿主抗ASFV天然免疫反应的调控网络还未完全阐述清晰。ASFV基因组左右可变区内存在大量属于不同多基因家族(MGFs)的基因，其中MGF360和MGF505/530已被证明是ASFV毒力决定因素，并通过抑制Ⅰ型IFN诱导或Ⅱ型IFN反应发挥作用(表1)。然而，这些蛋白的作用机制还不清楚，单个基因的功能还不明了。此外，I329L作为TLR3信号的激动剂，需要进一步研究其在感染细胞和宿主的作用机制。目前，A179L已被证明是ASFV抑制细胞凋亡的一个主要基因，但还没有获得删除A179 L基因的重组病毒，以确定其抑制凋亡的机理，这些都需要进行深入、系统的探究，从而为开发疫苗和抗病药物提供新的思路和策略。

表1 ASFV基因在调控宿主天然免疫系统中的功能