灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞产生白介素10的影响

孙 博，孙 宇，车姣子，李雪飞，陆 洁，段昕所*

（1.承德医学院附属医院，河北承德 067000； 2.承德市中心医院）

黑素瘤是由正常黑素细胞或神经嵴细胞癌化后的黑素细胞导致的恶性肿瘤[1]，具有恶性程度高、易转移的特点。世界范围内，每年大约有9000例患者死于黑素瘤，在皮肤肿瘤死亡患者中约占60%～80%，我国每年新发病例约2万多例，美国疾控中心预测黑素瘤患者的数量在未来15年内还会增加[2-4]。抑制并逃避机体免疫系统而得以生存与黑素瘤细胞自身存活密切相关，目前已知黑素瘤细胞可以通过自分泌—旁分泌等途径分泌IL-10、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、转化生长因子β（transforming growth factor-β，TGF-β）等免疫抑制因子来逃避免疫监视，逃避机体免疫系统的识别与攻击，为肿瘤的发生及发展创造有利的微环境[5]。灵芝多糖是一种从灵芝子实体中被提取出来的多糖组份，已有研究表明，灵芝多糖具有一定的免疫调节功能以及一定的抗肿瘤等作用[6]。灵芝多糖如何抑制肿瘤细胞的免疫逃逸仍是目前研究的热点内容。本研究通过探讨灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞产生IL-10的影响，进一步明确黑素瘤发生发展机制，为黑素瘤治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料与试剂

灵芝多糖为福州绿谷生物药业技术研究所分离提取，北京大学医学部基础医学院药理学系林志彬教授惠赠。B16F10黑素瘤细胞株（协和医科大学细胞库），胎牛血清（FBS，天津血液学研究所），IL-10一抗、β-actin一抗（美国Santa Cruz公司），Western-blot二抗（北京中杉金桥生物技术有限公司），RPMI-1640、Trizo（美国Invitrogen公司），AMV反转录试剂盒引物由上海生工生物公司设计合成。

1.2 方法

1.2.1 B16F10黑素瘤细胞培养 在37℃、5% CO2培养箱中，将B16F10黑素瘤细胞（2×105个/孔）置于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基的6孔板内培养，培养4h贴壁后，实验组分别加入不同浓度的灵芝多糖（0.2μg /mL，0.8μg /mL，3.2μg/mL，12.8μg /mL），对照组RPMI-1640培养基不加灵芝多糖，继续培养48h，用于下列实验。

1.2.2 Western blot法 收集不同浓度灵芝多糖作用48h的细胞，采用BCA法提取蛋白并定量。采用SDS-PAGE凝胶电泳（50μg），转膜，用含5%脱脂牛奶封闭2h，加1：100:稀释的IL-10一抗、1：1000稀释的β-actin一抗，4℃孵育过夜；TBST洗3次，每次10min，1：1000稀释的IL-10二抗、1：2000稀释的β-actin二抗室温孵育2h；TBST洗3次，每次5min，洗涤后于凝胶成像分析系统中滴加ECL发光液，采集图像，测定条带的灰度值，以β-actin作为内参。

1.2.3 RT-PCR方法 按Trizol试剂说明书提取组织总RNA。分光光度计检测RNA浓度及纯度，采用1%琼脂糖凝胶电泳对其检测。逆转录反应、PCR反应及操作步骤均严格按照试剂盒说明书进行。引物序列：内对照小鼠β-actin上游引物5'GGTACCACCATGTACCCAGG3′，下游引物5′ACATCTGCTGGAAGGTGGAC3′；IL-10上游引物5'CGGGAAGACAATAACTG3'，下游引物5'CATTTCCGATAAGGCTTGG3'。β-actin反应条件为：预变性95℃ 5min，变性95℃、退火60℃各45s，延伸72℃ 30s，重复30次，最后延伸72℃ 10min。IL-10反应条件为：预变性95℃ 5min，变性95℃、退火55℃各45s，延伸72℃ 30s，重复35次，最后延伸72℃ 10min。将产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，经凝胶成像系统采图，进行分析。

1.3 统计学处理

2 结果

2.1 Western-blot法检测B16F10黑素瘤细胞IL-10表达

在不同浓度灵芝多糖作用下，B16F10黑素瘤细胞表达IL-10的蛋白含量受到抑制作用，与0μg/mL灵芝多糖组相比较，12.8μg/mL灵芝多糖组有统计学意义（F=7.498，P＜0.05)，如图1：

图1 B16F10黑素瘤细胞表达IL-10 Western-blot检测结果

2.2 RT-PCR法检测B16F10黑素瘤细胞IL-10的表达在不同浓度灵芝多糖作用下，B16F10黑素瘤细胞mRNA含量受到抑制，且随灵芝多糖浓度的不断增高，IL-10的表达量逐渐减少，呈剂量依赖趋势。与对照组比较，除0.2μg/mL灵芝多糖组，其他组均具有统计学意义（F=16.806，P＜0.05)，如图2：

图2 B16F10黑素瘤细胞表达IL-10 RT-PCR检测结果

3 讨论

黑素瘤是细胞的异常增生的结果，机体在内外多种因素的作用下导致肿瘤的发生与发展，同时肿瘤细胞为了自身生存也在适应其所处的复杂微环境[7]。肿瘤细胞产生免疫抑制分子抑制机体的抗肿瘤免疫反应对肿瘤细胞在体内生存具有重要作用。

TGF-β1、VEGF和IL-10是三种常见的肿瘤细胞产生的具有免疫抑制作用的细胞因子。TGF-β1在肿瘤晚期可增加血管生成、抑制免疫功能，促进肿瘤的侵袭和转移[8]。VEGF可通过自分泌或旁分泌方式降低免疫系统对肿瘤的排斥反应，加速血管生成作用，逃避免疫系统的攻击[5]。IL-10具有免疫抑制效应，抑制机体抗原提呈细胞、T细胞和固有免疫细胞的活性及功能，导致宿主处于免疫功能低下状态或免疫抑制状态，产生肿瘤易于生存的肿瘤微环境，从而在免疫应答诱导和效应的多个环节上抑制机体抗肿瘤免疫反应，加速肿瘤的发生发展[9,10]。黑素瘤细胞可分泌IL-10，还作为自分泌生长因子促进肿瘤生长[11]。因此，IL-10的分泌对肿瘤的免疫逃逸及对疾病预后及转归至关重要，本研究结果显示，较高浓度灵芝多糖可有效抑制IL-10的分泌。

灵芝多糖是灵芝的主要成分[12]。张晓春等[13]研究证实灵芝多糖可以抑制肿瘤血管的生成，从而抑制肿瘤生长及转移。邢会军等[14]实验表明，灵芝多糖可以有效的抑制胃癌细胞增殖，促进胃癌细胞的凋亡。有文献报告黑素瘤细胞上清液（B16F10-CS）的IL-10升高，在淋巴细胞与小鼠B16F10黑素瘤细胞上清液培养基中加入灵芝多糖后，淋巴细胞穿孔素和颗粒酶B分泌增加[15]。本实验结果显示，灵芝多糖可抑制黑素瘤细胞分泌IL-10。李乔等[16]的研究结果显示，肿瘤相关巨噬细胞可能通过上调IL-10水平促进癌细胞侵袭和转移。Lu等[17]研究显示，灵芝多糖可以减弱黑素瘤细胞对巨噬细胞的抑制，恢复免疫细胞的抗肿瘤免疫功能，进而认为灵芝多糖可能通过提高机体免疫力来抵制肿瘤生长。Sun等[18]利用灵芝多糖分别孵育小鼠B16F10黑色素瘤细胞、小鼠肺腺癌LA795细胞，测定IL-10及其mRNA水平，结果显示，在较高浓度灵芝多糖作用下，IL-10及其mRNA水平均受到抑制。与本实验研究结果相同。因此，灵芝多糖有可能通过抑制IL-10的分泌抑制肿瘤细胞的增殖；可通过恢复淋巴细胞等免疫细胞的功能[19,20]，恢复机体免疫防御功能，达到清除肿瘤细胞的作用。

本研究提示，较高浓度灵芝多糖对B16F10黑素瘤细胞产生IL-10具有抑制作用。因此，寻找有效方法来减少IL-10的分泌，可能对肿瘤治疗有效，从而为肿瘤的免疫治疗寻求新方法。