膜联蛋白A7低表达对人胃癌MGC-803细胞迁移和侵袭的影响

柏友兰，刘明伟，王小杰，李 欣

（承德医学院基础医学院，河北承德 067000）

胃癌被认为是目前全球范围内最常见的恶性肿瘤之一，特别是在中国和其他亚洲国家，死亡率均居于恶性肿瘤平均死亡率的第2位[1]。其早期症状缺少特异性，多数病例在确诊过程中已被认定为中晚期，且致死率高，5年内生存能力差，严重威胁了人类的生命健康。所以，了解它们的发病机理、寻找合适的诊断和预后指示标志物意义重大。膜联蛋白（annexin）是钙离子依赖的磷脂结合蛋白，与细胞转化、癌症进展和肿瘤转移有关[2]。膜联蛋白A7（annexin A7，ANXA7）又称synexin，属于A组Annexin家族。研究发现在大多数胃肠道癌症中，ANXA7异常表达，是一种特异性的促癌候选基因[3]。然而，其对胃癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响目前尚不清楚。因此，本研究通过在胃癌MGC-803细胞中敲低ANXA7，观察其可否引起细胞迁移和侵袭的改变，从而探讨膜联蛋白A7在胃癌转移过程中的临床意义。

1 材料和方法

1.1 试剂和仪器设备

细胞1640培养液及胎牛血清FBS（Gibco公司，美国）；靶向ANXA7及阴性siRNA（吉玛基因，苏州）；lipo2000转染试剂（Invitrogen公司，美国）；GAPDH、ANXA7、E-cadherin和MMP-9兔抗人单克隆一抗（Epitomics公司，美国） ；山羊抗兔二抗（KPL公司，美国）；Transwell小室（康宁公司，美国）；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白定量试剂盒（索莱宝生物科技，北京） ；CO2培养箱（HER Aceu150，贺利公司，德国）；MK3酶联蛋白检测仪（Thermo公司，美国）；ECL发光仪（Tanon6100，上海天能公司）。

1.2 细胞培养及转染

于上海赛百慷生物公司购入人胃癌细胞系MGC-803，使用的1640细胞培养液含10% FBS，置于5% CO2的细胞培养箱中37℃恒温培养。将细胞接种于6孔板中，次日用于转染，约（3~5）×104个/孔，分为si-ANXA7组、阴性对照组（si-con）和空白对照组（blank）；24h后细胞均匀铺满皿底面积的40%~70%。将30pmol/L的siRNA Ologo与250μl无血清的RPMI1640细胞培养液轻柔混匀，静置5min；再将5μl转染试剂Lipo2000与250μl无血清1640培养基轻柔混匀，亦静置5min。Lipo2000转染试剂分别与靶向ANXA7的siRNA和阴性对照siRNA混合均匀，静置20min后，分别将混合液准确加至干扰组及阴性对照组培养孔中，空白对照组则加2ml常规培养基，放入二氧化碳箱中。6h后换液，更换为含10%血清的RPMI1640培养基，继续培养。

1.3 Western blotting检测siRNA转染后MGC-803细胞ANXA7抑制效率

转染48h后收集细胞，每孔加入120μl RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测出浓度后，将蛋白与5×Loading Buffer混合，置于100℃煮沸变性10min。制作12% SDS-PAGE凝胶，每样品孔等质量加入30μg蛋白，80~120V蛋白电泳2h。电泳后湿转法（200mA，1.5h）将蛋白转印至PVDF膜上，再将膜放入5% 脱脂奶粉溶液中封闭2h，GAPDH（1:1000），ANXA7（1:1000）单克隆抗体于4℃孵育一夜；次日用TBST洗3次，时间分别为15min、10min、5min，以洗掉非特异性结合的一抗；山羊抗鼠二抗（1:5000）室温孵育1.5h，TBST再洗3次，每次6min；最后放入ECL化学发光仪显影。用Quantity One软件分析图像，计算ANXA7/GAPDH数值，ANXA7蛋白的相对表达量即被测出。

1.4 细胞划痕实验检测各组MGC-803细胞迁移能力的变化

六孔板中细胞转染48h后，在含10%胎牛血清的培养基中生长成90%密度的融合单层。用200μl枪头沿着直尺，垂直于培养板底部均匀地划出一条直线；吸去旧培养基，并用PBS缓冲液冲洗3次以清除划下的细胞碎片；再在每孔中加入新鲜的无血清RPMI1640培养基，放回恒温孵箱中继续培养；分别于0、12、24、36、72h用光学显微镜观察并测量初始划痕间隙宽度（0h）和剩余划痕间隙宽度。

1.5 Transwell实验检测各组MGC-803细胞侵袭能力的变化

siRNA转染后48h，用0.25%胰蛋白酶消化细胞，用含10%胎牛血清的培养基终止消化，轻轻吹打混匀后，取100μl单细胞悬液置入Transwell小室的上部；再在Transwell下室中置入600µl含20%胎牛血清（FBS）的RPMI1640细胞培养液作为化学诱导剂，以血清浓度差作为趋化条件；移入5% CO2培养箱中，37℃培养24h。之后取出小室，吸弃室内培养基，甲醇固定细胞5min，弃固定液，再用Giemsa染液染色3min；自来水慢慢洗去染色液，用棉签擦除小室上表面的细胞，快速干燥后，将聚碳酸醋膜切下贴于载玻片上，滴加中性树胶，再盖上盖玻片封片。于显微镜下观察并摄片（100倍），随机选取5个视野计数细胞，并计算出观察到的5个视野中的平均细胞数。

1.6 Western blotting检测E-cadherin、MMP-9蛋白的表达

收集细胞，每孔加入120µl RIPA裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA蛋白定量法测出浓度后，将蛋白与样品处理液均匀混合，置于100℃煮沸变性10min。制作12% SDS-PAGE凝胶，每样品孔30µg等质量上样，80~120V电泳2h。电泳后湿转法（200mA，1.5h）将蛋白转印至PVDF膜上，再置入5%脱脂奶粉溶液中封闭2h，GAPDH（1:1000），E-cadherin、MMP-9兔抗人单克隆一抗（1∶2000）于4℃孵育一夜；次日取出用TBST洗3次，时间分别为15min、10min、5min以洗掉非特异性结合的一抗；山羊抗兔二抗（1:5000）室温孵育1.5h后，TBST再洗3次，每次洗6min；最后放入ECL化学发光仪显影。用Quantity One软件分析图像，分别计算E-cadherin、MMP-9条带与GAPDH条带的灰度值比，即为E-cadherin、MMP-9蛋白的相对表达量。

1.7 统计学处理

实验数据均以均值±标准差（）表示，应用SPSS 19.0统计学软件对数据进行处理，组间两两比较采用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 靶向ANXA7的siRNA抑制效率鉴定

Western blotting检测结果显示（图1），干扰组ANXA7的表达显著低于阴性组和空白对照组（P＜0.05），差异有统计学意义。阴性组和空白对照组相比，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图1 Western blot检测ANXA7蛋白的表达

2.2 ANXA7下调后各组细胞迁移情况

MGC-803细胞转染后48h行细胞划痕，分别于0h、12h、24h、36h、72h摄片记录划痕愈合情况。结果显示（图2），与阴性组和空白对照组相比，siRNA干扰组细胞迁移能力明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；阴性组和空白对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图2 各组细胞划痕愈合情况

2.3 ANXA7下调后各组细胞侵袭情况

Transwell结果显示（图3），与阴性组和空白对照组相比，siRNA干扰组细胞侵袭能力明显下调，差异有统计学意义（P＜0.05）；阴性组和空白对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图3 各组细胞Transwell侵袭实验结果

2.4 各组细胞E-cadherin及MMP-9的表达

siRNA干扰组E-cadherin蛋白表达显著高于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；siRNA干扰组MMP-9蛋白表达显著低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；阴性对照组和空白对照组相比差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 Western blot检测E-cadherin及MMP-9蛋白的表达

3 讨论

胃癌作为第二大高死亡率的恶性肿瘤，其发病率位居世界第四。尽管近年来手术技术和抗癌药物有所完善，但胃癌患者的五年生存率仍处于较低水平[4]。手术切除是胃癌最常见的治疗策略，基因组测序和精准治疗的进展则开创了新的癌症治疗方法，但无论是靶向治疗还是新的辅助化疗都没有能明显改善晚期胃癌患者的预后[5,6]。因此，开发新的胃癌早期诊断和预后生物标志物是目前当务之急。

ANXA7是脊椎动物细胞膜联蛋白家族的重要成员，含有一个超长的氨基末端，在胞吐过程的膜融合中起重要作用[7]。其主要在细胞质中表达，分布广泛于心脏、脑和骨骼肌。它在细胞骨架活性、膜磷脂化、膜受体调节以及有丝分裂中发挥重要功能[8]。据报道，ANXA7在肿瘤的发生、发展、侵袭和转移中起重要作用[9]。有学者在既往研究中了解到，ANXA7蛋白表达水平与肿瘤转移呈正相关，还发现miR-124-3p通过下调ANXA7基因降低Bcl-2、MMP-9等的表达，从而抑制肝癌细胞的生长、侵袭和淋巴结转移，并证实ANXA7促进了肝细胞癌的进展和转移[10]。Hu等[11]研究发现，ANXA7在低分化的胃癌细胞系和高度侵袭性的人胃癌组织中都有高表达，认为ANXA7的高表达是胃癌患者淋巴结转移和预后不良的潜在指标，但ANXA7对胃癌细胞的具体作用机制尚不清楚。还有学者研究发现在胃癌患者中，胃癌的分化程度与ANXA7的表达水平呈负相关，因此认为ANXA7可能是预测胃癌淋巴结转移的潜在因子，提示ANXA7的表达可能是肿瘤侵袭的候选生物标志物[12]。在这些结果的基础上，我们认为ANXA7的高表达增强了胃癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力。与肿瘤转移的关系较为紧密的基质金属蛋白酶分别为基质金属蛋白酶-2和基质金属蛋白酶-9，二者能起到降解基底膜上IV型胶原的作用。先前的研究结果表明，MMP-9的表达与胃癌发展和淋巴转移有着紧密联系[13]。我们的研究表明，ANXA7的低表达显著下调了MGC-803细胞的侵袭能力及MMP-9的表达，提示下调MMP-9活性可能是ANXA7抑制MGC-803细胞侵袭转移的机制之一。

钙粘附素是一种跨膜糖蛋白，能起到维持上皮结构及细胞极性等作用[14]。E-cadherin叫做E-钙粘蛋白（E-cad），作为上皮细胞间的粘附连接最关键、最普遍的成分之一，在功能上与极化上皮表型的产生有关。大量研究表明，E-cad的下调、突变或功能丧失可能与多种癌细胞的侵袭和转移表型有关。在过去的几十年中，E-cad的抑瘤功能已经出现在包括胃癌在内的不同种上皮型肿瘤中，在肿瘤的发生发展中观察到它的下调，此现象还关系到肿瘤的侵袭转移。有研究将E-cad定义为肿瘤浸润转移抑制基因，其表达增多会抑制不同种类癌症的浸润与转移[15]，而其表达的逐渐减少与体内癌细胞浸润、转移和去分化有关。我们的研究表明，在MGC-803细胞中抑制ANXA7表达后，E-cadherin的表达上升，并抑制细胞的迁移。提示ANXA7低表达通过上调E-cadherin的表达抑制MGC-803细胞的迁移能力。

综上所述，敲低ANXA7可能通过上调E-cadherin并下调MMP-9的表达来抑制MGC-803细胞的迁移性和侵袭性，但具体通过哪条通路发挥作用还需进一步的研究来揭示。作为促进胃癌发生发展的癌基因，使用ANXA7 siRNA的方法可能为胃癌患者带来新的治疗选择。