流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群的常见问题及其解决方案

段萃娟，凌爱琴，张 翠，王瑞玲，宋 娜，王玉飞

淋巴细胞亚群是构成机体免疫系统的主要细胞群，参与机体细胞免疫和体液免疫，它可通过流式细胞仪被检测，临床上多用于监测肿瘤、感染、移植、过敏患者的免疫状况。流式细胞仪(flow cytometer，FCM)集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机技术、细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体，广泛应用于生物学及临床医学的研究[1-4]。本研究对解放军总医院第三医学中心检验科2018年流式细胞仪日常检测外周血淋巴细胞亚群过程中遇到的常见问题进行分析、总结，并提出解决方案，以提高检测结果的准确性。

1 材料与方法

1.1 样本与仪器设备 选取2018年检测的淋巴细胞亚群样本14 236例。空腹采集EDTA-K2抗凝静脉血3 ml。使用迈瑞BriCyteE6流式细胞仪,试剂均为深圳迈瑞公司产品：四色流式试剂CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC，CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC，Flow-Count标准荧光微粒及FACS溶血素(10×)。

1.2 方法

1.2.1 流式细胞仪质控测试 采用Flow-Count标准荧光微粒，通过MRFlow软件自动完成对仪器的质量控制。

1.2.2 样品制备 取2只检测管，分别标记A和B，A管内加入20 μl CD3-FITC/CD8-PE/CD45-PerCP/CD4-APC抗体，B管内加入20 μl CD3-FITC/CD16+56-PE/CD45-PerCP/CD19-APC抗体，然后分别加入50 μl EDTA抗凝静脉血至管底。试管在旋涡混匀器上轻旋混匀，室温避光孵育15 min；向试管内加入1×溶血素450 μl，在旋涡混匀器上轻旋混匀，室温避光孵育15 min；待红细胞充分裂解后，涡旋混匀，分别上机检测。

1.2.3 流式分析 应用MRFlow软件自动分析，CD45/SSC散点图建立P1门选中淋巴细胞，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散点图建立十字门圈定对应区域的细胞(以CD3/CD4为例)。A管建立CD45/SSC、CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8散点图，B管建立CD45/SSC、CD3/CD19、CD3/CD16+56散点图，从而获得淋巴细胞各亚群的绝对计数和百分比。

2 结 果

2.1 CD45-SSC门散点图分群不清 正常情况下，CD45/SSC散点图中可圈出CD45淋巴细胞(图1A)，但是在1例肾病综合征患者进行外周血淋巴细胞亚群检测时，散点图中无法圈出CD45淋巴细胞(图1A)，绝对计数和分类结果均受影响。

2.2 十字门分类散点图分群不清 正常情况下，CD3/CD4、CD3/CD8、CD4/CD8、CD3/CD19、CD3/CD16+56散点图可用十字门进行明确的区域划分(图1)。在检测时，经常会出现散点图弥散、蔓延其他区域，无法明确分区的情况(图1B)，导致淋巴细胞各亚群分类有误，以至于各亚群绝对计数和百分比结果不准确。该种情况主要见于溶血时间不够、红细胞过多或病态红细胞导致的溶血不充分。

2.3 淋巴细胞亚群无法分群 部分肝移植患者在检测外周血淋巴细胞亚群时会出现无法分群的情况。有CD45-SSC无法分群(图2A)，部分患者CD3、CD4、CD8、CD19及CD16+56散点图无法分群(以CD3/CD4、CD3/CD19散点图为例，见图2B、3C)，而不能获得绝对计数结果。

2.4 淋巴细胞亚群细胞绝对计数假性减低 当患者血细胞出现聚集状态时，淋巴细胞不能充分地同特异性荧光标记抗体相结合，从而导致淋巴细胞亚群细胞绝对计数结果假性降低。图2A就是一例不明原因无法分群而导致的绝对计数结果假性减低，在审图时发现结果异常。

2.5 解决方案

2.5.1 上机前溶血素清洗 上机前在试管内加入双倍体积溶血素(900 μl)，震荡混匀，待红细胞充分裂解管中液体变得透亮后上机检测，同时调整仪器的体积倍数；或者加入溶血素后150 g离心5 min，小心吸取450 μl上清弃除，以保持上样前体积倍数不变。如果结果不理想可再次重复操作。该方法主要适用于利用体积法绝对计数的流式细胞仪，可以解决其十字门分类散点图分群不清的问题(图1D)。

2.5.2 样品制备前生理盐水清洗 在样本制备前，取200 μl全血加入800 μl生理盐水，震荡混匀后150 g离心5 min，小心吸取上清弃除，重复操作一次后，将剩余的200 μl沉淀混匀。此后再按照1.2.3的方法制备样品及上机检测。该方法可以解决高凝状态标本、药物等不明原因引起CD45-SSC门散点图分群不清、淋巴细胞亚群无法分群以及淋巴细胞亚群细胞绝对计数假性减低的问题(图1C、图2D、图2E、图2F)。

3 讨 论

随着流式细胞技术的发展，流式细胞仪的应用越来越广泛，流式细胞仪的品牌及种类也越来越多。目前流式细胞仪测量淋巴细胞亚群绝对计数的单平台方法有两种，一种是基于Trucount管的微球法，另一种是基于流量传感器的体积法，这两种方法之间具有较好的一致性[5]。我们使用的是迈瑞BriCyte E6流式细胞仪，其绝对计数方法是基于流量传感器的体积法，具有较好的准确性和重复性[6-8]。但是，由于体积法为了保证样本体积精确，加溶血素后直接上机，易导致检测时出现散点图分群不清的问题，对此，我们根据BriCyte E6流式细胞仪绝对计数原理提出了相应的解决方法：(1)上机前溶血素清洗。上机前在试管内加入双倍体积溶血素(900 μl)，震荡混匀，待红细胞充分裂解管中液体变得透亮后上机检测，同时调整仪器的体积倍数；或者加入溶血素后150 g离心5 min，小心吸取450 μl上清弃除，以保持上样前体积倍数不变。如果结果不理想可再次重复操作。该方法主要适用于利用体积法绝对计数的流式细胞仪，可以解决其十字门分类散点图分群不清的问题(图1D)。(2)样品制备前生理盐水清洗。在样本制备前，取200 μl全血加入800 μl生理盐水，震荡混匀后150 g离心5 min，小心吸取上清弃除，重复操作1次后，将剩余的200 μl沉淀混匀。此后再制备样品及上机检测。该方法可以解决高凝状态标本、药物等不明原因引起CD45-SSC门散点图分群不清、淋巴细胞亚群无法分群以及淋巴细胞亚群细胞绝对计数假性减低的问题(图1C、图2D、图2E、图2F)。

图1 外周血淋巴细胞亚群分群不清散点图清洗前后对比

上机前溶血素清洗主要解决药物、血液病等原因引起的红细胞不完全溶血、血小板碎片过多的问题。另外，感染、炎症、血液病等引起的白细胞增高、组织破坏引起的纤维蛋白增高也可以影响淋巴细胞亚群的检测结果，样品制备前生理盐水清洗可以解决这些问题，特别是白细胞严重增高的标本，使用生理盐水稀释后根据其稀释比例调整仪器计算体积比得到绝对计数结果。为了保证结果的可靠性，对需要清洗标本在实验室日常使用的质控在控、运行正常的SYSMEX XN-2000全血细胞分析仪上进行检测，并对淋巴细胞绝对值进行比较，差异无统计学意义(P>0.05)，结果具有较好的一致性(ICC=0.915，P<0.001)。

肝肾移植患者术后需要定期监测外周血淋巴细胞亚群，评估机体免疫状态，以期为临床进行免疫干预治疗提供参考依据[9-12]。但是，移植患者，尤其是长期生存的移植受者，由于术后长期使用免疫抑制剂可能会影响到淋巴细胞亚群的检测结果，导致淋巴细胞亚群无法分群的现象。图2B、C即为1例肝移植术后12年的移植受者外周血淋巴细胞亚群检测结果图，该患者术后长期使用免疫抑制剂，突然以临床突发蛋白尿、血尿入院，其他结果均正常。此类患者导致淋巴细胞亚群无法分群的具体原因目前尚不清楚，推测可能与外周血中存在干扰物质有关，因此通过样品制备前生理盐水清洗可以较好地解决该类问题。

淋巴细胞亚群细胞绝对计数假性降低多见于慢性肾脏病(chronic kidney disease，CKD)晚期患者。在CKD患者血浆中，Fg、PT、D-D 等凝血因子升高，同时还存在TC、ET-1、Ca2+、ALB、CRP 等影响CKD 高凝状态的危险因素[13-16]。这些可使患者的外周血细胞出现聚集状态，从而不能充分地同抗体相结合，导致绝对计数结果假性减低(图2A)。样品制备前生理盐水清洗可去除血细胞的高聚状态，从而可以较好地解决该问题。

图2 外周血淋巴细胞亚群无法分群散点图清洗前后对比

迈瑞BriCyte E6流式细胞仪在进行结果分析时，需要计算标本体积和上样管内体积之比，正常情况为1∶10.4。为防止反复清洗过程中弃除上清造成的体积不准确，在溶血素清洗过程中可以省略弃上清这一步，直接调整仪器的计算体积比从而得到可靠的计数结果。同样，在生理盐水清洗过程，若不能弃去与加入生理盐水同等体积的上清，也可以根据加样比例来调整仪器计算体积比。

由于迈瑞流式细胞仪是根据体积法进行的计数，在样品制备过程中需要特别注意加样的准确性，因此对操作人员的加样要求较严格。在样品制备过程中最好使用反向加样法，反向加样法适用于黏稠液体，不但可以保证体积的准确、无气泡，而且不用打出多余的体积。加样前拭去枪头外黏附的多余液体也是提高加样准确性的方法之一。

综上所述，本研究根据所使用的流式细胞仪绝对计数原理，建立相应流式细胞仪检测外周血淋巴细胞亚群常见问题的处理方案，可以提高检测结果的准确性。而且由于解决方案简便可行，适合推广应用。