基于非靶标血清代谢组学研究桔梗预防急性肺损伤的潜在作用机制

周杨,谢彤,时晨,康安,邓海山,单进军

(1.南京中医药大学中医儿科学研究所,江苏省儿童呼吸疾病(中医药)重点实验室,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学药学院,江苏 南京 210023)

急性肺损伤(Acute lung injury,ALI)是各种肺内外致病因素如严重感染、创伤、中毒、弥散性血管内凝血等导致的急性弥漫性炎症性肺损伤,以肺血管通透性增高、肺泡腔渗出富含蛋白质的液体、肺水肿及透明膜的形成为主要病理特征,可迅速发展为急性呼吸窘迫综合征[1-3]。课题组前期对桔梗汤治疗ALI进行了研究,发现桔梗汤对ALI小鼠有一定的保护作用[4],但是其单味成分桔梗的作用机制尚不清楚。

代谢组学是组学领域的一大重要分支,主要用来研究各种小分子代谢物如氨基酸、脂肪酸等的动态变化,采用高通量的色谱、质谱等技术,结合统计学方法进行数据分析,识别并定量生物样本的代谢物,从而反映复杂生命体的整体功能[5-7]。近年来,代谢组学越来越多地运用到中医药领域中,尤其是疾病机制的研究[8]。本实验采用GC-MS技术分析桔梗给药前后ALI小鼠血清代谢物及代谢通路的变化,研究桔梗预防ALI的潜在作用机制。

1 材料

1.1 动物

24只雄性SPF级C57BL/6J小鼠,体质量18～22 g,购自河南斯克贝斯生物科技股份有限公司,生产许可证号:SCXK(豫)2020-0005,于南京中医药大学动物中心SPF级动物饲养房适应性饲养3 d,温度(22±2)℃,湿度(75±5)%,清洁饮水,昼夜控制各12 h。实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2018-0049,所有动物实验设计和方案均获得南京中医药大学动物伦理委员会同意和批准(伦理批号:201909A036)。

1.2 药物与试剂

桔梗(批号:101206)购于安徽丰原铜陵中药饮片有限公司;脂多糖(LPS,批号:0000081277)，甲氧胺盐酸盐(批号:BCBN2932V,纯度:98%),吡啶(批号:STBD3537V,纯度:99.8%),N-O-双(三甲硅基)三氟乙酰胺(BSTFA,批号:BCBS4254V,纯度:98.5%)，1,2-13C肉豆蔻酸(批号:SH2326V,纯度:99%)均购于美国Sigma-Aldrich公司;正己烷(批号:4A6004,纯度:95%)购于美国ROE公司;甲醇(批号:I880707710,纯度:99.9%)购于德国Merck公司;实验用水为娃哈哈纯净水;地塞米松片(批号：2004150211，规格:0.75 mg×100片)购于辰欣药业股份有限公司;Trizol试剂(批号:252701)购于美国Thermo Fisher Scientific公司;引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,见表1。

表1 引物序列

1.3 仪器

Trace1310-TSQ8000气相色谱-质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司),TG-5MS毛细管色谱柱(0.25 mm×30 m,0.25 μm,美国Thermo Fisher公司),CPA225D型电子天平(德国Sartorius公司),Revco UXF型超低温冰箱(美国Thermo Fisher公司),Vortex-Genie2涡旋振荡仪(美国Scientific Industries公司),Allegra64R型离心机(美国Beckman Coulter公司),SPD1010-230型离心浓缩仪(美国Thermo Fisher公司)。

2 方法

2.1 桔梗水提液的制备

称取桔梗药材75.5 g,加水至0.9 L,浸泡30 min,先武火煮沸,再文火煎煮1.5 h,倒出药液冷却;再加入0.75 L水,先武火煮沸,再文火煎煮1 h,混合2次药液,用纱布过滤,减压浓缩至含生药量为0.755 g·mL-1的桔梗水提液。

2.2 ALI模型的制备

24只SPF级C57BL/6J雄性小鼠随机分为空白组、模型组、阳性药(地塞米松)组和桔梗组,每组6只。适应性饲养3 d后,灌胃给药,连续7 d,空白组、模型组给予生理盐水10 mL·kg-1·d-1,阳性药组给予相应剂量的地塞米松混悬液10 mg·kg-1·d-1(取30片地塞米松片于研钵中研磨成粉末,装入50 mL收集管中并加入22.5 mL娃哈哈纯净水配置成浓度为1 mg·mL-1的地塞米松混悬液),桔梗组给予7.55 g·kg-1·d-1的桔梗水提液。第7天给药1 h后气管滴注1 mg·mL-1LPS(3 mg·kg-1)造模,6 h后处死。

2.3 生物样本的收集

血清样本的收集:LPS造模6 h后,小鼠眼球取血,静置0.5 h,4 000 r·min-1离心10 min,吸取上清于离心管中,-80 ℃冰箱备用。肺组织样本的收集:眼球取血后,脱颈椎处死小鼠,解剖并采集左肺中叶用于病理检测,同时称取10 mg肺组织,用qPCR技术检测肺组织相关炎症指标mRNA表达情况。

2.4 检测指标

2.4.1 肺组织HE染色 取用4%多聚甲醛溶液固定的肺组织,乙醇梯度脱水,2次二甲苯透明,石蜡包埋,切片,用苏木精-伊红染色,通过光镜观察肺组织病理变化。

2.4.2 肺组织相关炎症指标的检测 称取10 mg小鼠肺组织,采用Trizol法提取小鼠肺组织中总RNA,随后将RNA反向转录为cDNA,贮存于-20 ℃备用。对IL-1β、IL-6和TNF-α相关炎症指标进行qPCR,每组重复3次实验,采用2-ΔΔCt法计算样本中mRNA相对表达。

图1 小鼠肺组织病理(×200)

2.5 非靶向血清代谢组学的检测方法

2.5.1 血清样品前处理 将2.3项中获得的血清样品置于冰上融化,取50 μL样品于含有200 μL甲醇溶液(含有12.5 μg·mL-1的1,2-13C肉豆蔻酸)的1.5 mL离心管中,涡旋5 min混匀,于4 ℃,18 000 r·min-1离心10 min,并取100 μL上清于另一干净的1.5 mL离心管中,用离心浓缩仪(温度:45 ℃,真空度:10 kPa)挥干。向挥干后的离心管中加入30 μL浓度为10 mg·mL-1甲氧胺吡啶溶液,涡旋5 min后置于恒温震荡仪中,30 ℃,300 r·min-1震荡1.5 h;再加入30 μL BSTFA(含1%四甲基硅烷),混匀后置于恒温震荡仪中,37 ℃,300 r·min-1震荡0.5 h。衍生化处理结束,4 ℃,18 000 r·min-1离心10 min,取50 μL上清于棕色进样小瓶内进样分析。

2.5.2 血清质控(QC)样本制备 从24个样本中各吸取10 μL。均匀混合后,吸取50 μL平行2次按照2.3项进行前处理操作。

2.5.3 GC-MS分析条件 梯度升温:0～1 min,60 ℃;1～14 min,60～320 ℃;14～19 min,320 ℃;分流模式:分流比20∶1;进样量:1 μL。电离方式:EI源;电离能:70 eV;离子源温度:280 ℃;离子传输线温度:250 ℃;质谱采用全扫方式,扫描范围:m/z50～500;载气:高纯度氦气(纯度>99.999%);气流流速:1.2 mL·min-1。

2.5.4 数据处理 将GC-MS采集的图谱信息,使用软件MS-DIAL和NIST数据库进行峰提取及物质鉴定,得到代谢物名称、组别、峰高组成的三维数据集。将数据集导入Metaboanalyst 5.0(http://www.Metaboanalyst.ca/),对数据进行总离子流归一化、Log转化及Pareto校准后,进行主成分分析(PCA),采用Wilcoxon检验和倍数差异(Foldchange),以P<0.05和Foldchange≥1.2或≤0.833 3为筛选条件获得差异代谢物质[4],用Metaboanalyst 5.0对数据进行聚类分析及代谢通路分析。

2.6 统计学方法

3 结果

3.1 桔梗在体内对LPS诱导的ALI有保护作用

如图1所示,空白组小鼠的肺组织呈现正常形态,支气管腔内无渗出物,肺泡壁未见增厚,周围组织及管壁无炎性细胞浸润。与空白组相比,模型组小鼠的肺形态出现异常,肺泡壁增厚,支气管上皮细胞出现变性、坏死,腔内见坏死细胞及大量渗出物,病变处结构不清晰,出现炎性细胞浸润。阳性药组和桔梗组的总体病变程度较模型组低,支气管周围出现部分炎细胞浸润,肺形态有异常。

qPCR检测结果如图2所示,模型组中肺组织炎症细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达水平较空白组有显著增加(P<0.01，P<0.000 1),阳性药组和桔梗组较模型组有显著的下调(P<0.01，P<0.001，P<0.000 1),提示桔梗可显著抑制ALI小鼠肺组织中促炎细胞因子mRNA的表达。

注:与空白组比较,**P<0.01,****P<0.000 1;与模型组比较,图2 肺组织炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α mRNA的表达

3.2 血清非靶向代谢组学研究

3.2.1 小鼠血清GC-MS分析总离子流图 血清样本所得的总离子流色谱图如图3所示。图中以最高色谱峰的离子强度为100%,图中各谱峰之间分离度良好。使用MS-DIAL及NIST数据库对色谱峰进行化合物的鉴定,可以从GC-MS谱图中鉴定得到115种代谢物,包括氨基酸、脂肪酸等小分子化合物。

3.2.2 小鼠血清代谢轮廓分析 如图4A所示,QC样品质控分析序列稳定性以及样品的重复性好。图4B中空白组、模型组、阳性药组和桔梗组间的代谢轮廓能明显区分,且分离程度好。经桔梗干预后,ALI小鼠血清代谢轮廓向正常组靠近,表明内源性代谢紊乱有所改善。桔梗对ALI有一定的预防作用。

注:A.空白组;B.模型组;C.阳性药组;D.桔梗组图3 小鼠血清样本GC-MS总离子流图

注:A.QC与血清样本的PCA图;B.各组小鼠血清样品的PCA图图4 小鼠血清样本PCA图

3.2.3 差异代谢物和代谢通路富集 筛选出空白组与模型组31个差异代谢物,桔梗水提液可通过回调前13个代谢产物改善小鼠血清代谢轮廓,见表2。将空白组和模型组以及模型组和桔梗组血清中筛选的差异代谢物通过MetaboAnalyst 5.0进行代谢通路分析,以代谢通路富集分析P<0.05和代谢通路拓扑分析富集值(Impact)>0.1为筛选条件,空白组和模型组共筛选得到4条相关代谢通路,模型组和桔梗组之间共筛选得到2条相关代谢通路,见图5和表3。

表2 血清样本差异代谢物

注:1.甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;2.丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢;3.乙醛酸和二羧酸代谢;4.三羧酸循环; A.模型组/空白组差异代谢物通路富集分析气泡图;B.桔梗组/模型组差异代谢物通路富集分析气泡图图5 血清样本差异代谢物通路富集分析气泡图

表3 血清样本差异代谢物通路富集分析结果

4 讨论

本研究从肺组织病理程度以及炎性因子mRNA的表达情况阐明了桔梗对ALI小鼠的预防作用。采用GC-MS技术检测小鼠血清中代谢物的变化情况,分析3组小鼠血清中差异代谢物及其相关代谢通路,研究桔梗预防ALI的潜在作用机制。

通过空白组和模型组差异代谢物富集分析,得到4条具有统计学意义的代谢通路:甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢通路,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路,乙醛酸和二羧酸代谢通路和三羧酸循环。同样将模型组和桔梗组差异代谢物进行富集分析得到2条具有统计学意义的代谢通路:甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢通路和丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路。发现甘氨酸、苏氨酸和丝氨酸代谢,丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢是两者共有的通路,可以分析得到,桔梗可能通过调控ALI相关的代谢通路发挥预防ALI的作用。由表2可以看出桔梗给药后回调最明显的是甘氨酸,有研究报道具有肺功能障碍的人常伴有甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸等氨基酸水平的降低,用甘氨酸预处理LPS所致的ALI可减少LPS诱发的肺泡细胞凋亡、胶原蛋白沉积，降低趋化及炎性细胞因子的表达，从而减轻ALI[9-11]。甘氨酸是谷胱甘肽(GSH)合成的前体,GSH在体内是一种重要的抗氧化剂,可以通过直接清除超氧化物和羟基自由基以及维持体内氧化还原平衡来保护机体损伤[12-13]。Nrf2是一种转录因子,可调节涉及保护肺和其他组织中氧化损伤基因的表达。有研究表明甘氨酸可以激活Nrf2信号,同时抑制NLRP3炎性体,发挥保护作用[14]。在LPS感染的小鼠中可以看出血清甘氨酸的水平明显降低,桔梗给药之后显著回调,这些结果表明桔梗的作用机制可能通过调节内源性代谢物的平衡,发挥抑制炎症反应和氧化活性的作用。天冬氨酸是丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路中重要的氨基酸之一,不仅可以参与蛋白质合成,为蛋白质合成提供原料,还可以作为赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸等氨基酸合成的前体。天冬氨酸在氨基酸降解中参与尿素循环,该循环需要2个氨基,其中1个由天冬氨酸提供。在三羧酸循环中,天冬氨酸还可以帮助细胞质中的NADH跨越线粒体膜,进入线粒体基质，对氧化磷酸化和能量产生来说是必需的[15-18]。这些途径直接或间接参与体内氧化还原反应、能量代谢等调节,表明桔梗的作用机制可能通过调节内源性代谢物的平衡,发挥着调节体内氧化还原平衡及能量代谢的作用。

综上所述,桔梗对ALI小鼠有一定的预防作用。本研究利用非靶向代谢组学的方法分析桔梗对ALI小鼠血清中代谢物的改变,发现空白组小鼠的代谢物轮廓与ALI小鼠具有明显差异,筛选出31个差异代谢物,桔梗通过作用于丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢通路和甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路改善ALI小鼠血清代谢物的紊乱，进一步预防ALI。差异代谢物和其代谢通路的分析有利于深层次地研究ALI的发病机制,为临床ALI的防治提供重要的理论依据。