衰老表型肝细胞外泌体对脂多糖致炎软骨细胞的影响及白芍的干预效应

张力，李晓辰，廖太阳，王培民，邢润麟

(南京中医药大学附属医院/江苏省中医院，江苏 南京 210029)

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)是运动系统最常见的退行性疾病之一，滑膜炎症、软骨破坏、骨赘生成是主要病理表现，发病机制至今未能完全明确，因而缺乏有效的针对性治疗方法。中医学多以症状特点将其归入“痹证”“骨痿”范畴[1-2]。软骨破坏是KOA病理进程中的一大核心环节。软骨的合成与分解之间的代谢平衡，在KOA的发生发展中有着至关重要的作用，这一病理环节以软骨细胞为中心[3]。越来越多的研究表明，从衰老角度去认识KOA，代谢因素在其中扮演重要角色。骨性关节炎被部分学者界定为一类代谢性骨病，而代谢综合征甚至被定义为KOA的一种常见亚型[4-5]。作为人体最大的代谢器官，肝脏在人体代谢活动中的作用非常关键。肝脏主要由肝实质细胞(即肝细胞)组成，数量最多，是肝脏代谢功能的主要执行者[6]。

研究表明，伴随机体衰老，肝细胞会逐渐呈现出细胞衰老表型，即细胞增殖分化能力停止，但细胞的基本功能仍得以保持[7]。在形态上出现细胞体积增大、核内陷、核膜溶解、染色质异常等结构；在功能上出现细胞复制能力丧失、周期停滞、衰老相关基因p16、p21、p53表达上调等[8]。这样的病理改变被证实可推动多类代谢性疾病进展[9-10]。基于在KOA软骨退变中细胞和细胞外基质的代谢紊乱以及肝细胞衰老对代谢功能的影响，二者之间是否存在联系引起相关学者的研究兴趣。

外泌体是一类由细胞分泌、直径在30～120 nm之间的细胞外囊泡，包裹了多种蛋白质、脂质、核酸等活性物质。其拥有富含受体的脂质膜性结构，可保护膜内miRNA、LncRNA等携带生物信息的活性物质在循环系统稳定传输，介导细胞间通讯、并可能通过远距传输的方式参与组织间对话[11]。研究表明肝细胞来源外泌体参与推动一些代谢类疾病的进程[12]，其对软骨代谢紊乱和最终退变有无作用仍然未知。中医学历来有“肝主筋”“膝为筋之府”的基础理论认识，“柔肝养筋”则是最常见的中医治膝处方选药原则，常用药如白芍、木瓜等[13-15]。既往有研究发现间充质干细胞来源、脂肪细胞来源的外泌体对KOA软骨细胞具有调控作用[16-18]。衰老表型肝细胞是否可能通过外泌体的分泌与软骨细胞形成对话，进而影响KOA软骨细胞的代谢平衡，柔肝养筋类中药是否可以在此环节发挥作用，研究主要是针对此问题开展。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

RNA快速提取试剂盒(货号：RN001，上海奕杉生物科技有限公司)，逆转录及PCR试剂(货号：R222-01、Q331-02，南京诺唯赞生物公司)，CCK-8试剂(货号：K1018，美国APExBIO公司)，过氧化氢、PKH67(货号：SML0790、MINI67-1KT，德国Sigma公司)，小鼠IL-1β、TNF-α ELISA试剂盒(货号：JEB-12787、JEB-12474，南京金益柏生物科技有限公司)，兔多克隆p16、p21、p53抗体(货号：AF0228、AF6290、AF0879，Affinity生物科技有限公司)，兔多克隆MMP3、MMP13，小鼠单克隆GAPDH抗体(货号：17873-1-AP、18165-1-AP、60004-1-Ig，武汉三鹰生物科技有限公司)，兔单克隆SOX9抗体(82630，美国CST公司)、兔多克隆ADAMTS5抗体(DF13268，美国Affinity Biosciences公司)、DMEM培养基、胎牛血清(美国Invitrogen Gibco公司)，JEM1230型透射电子显微镜(日本JEOL公司)，纳米颗粒追踪分析仪(德国Particle Metrix公司)，ABI 7500 qPCR系统(美国Applied Biosystems公司)，2D蛋白电泳系统、超灵敏化学发光成像系统LAS4000(美国GE公司)，EL800酶标仪(美国BIOTEK公司)，荧光倒置显微镜摄像系统(德国Leica公司)，CO2细胞培养箱(美国Thermo公司)

1.2 方法

1.2.1 小鼠肝原代细胞培养及分组 0.3%戊巴比妥钠麻醉状态下开放小鼠腹腔，肝叶上翻使肝脏门静脉及下腔静脉充分暴露。门静脉插管，恒流泵按5 L·min-1流速生理盐水持续灌注，剪开下腔静脉形成回流。待肝脏呈土黄色，泵入0.2%Ⅳ型胶原酶，周身流注后夹闭下腔静脉充分消化。随后摘取肝叶，培养基中用镊子撕开肝脏包膜，抖落肝原代细胞，梯度离心纯化，细胞计数并调整每皿含1×107个细胞，培养箱孵育，24 h后换用无外泌体血清培养，用于后续实验。

根据实验目的将肝细胞随机分为空白组、衰老组和白芍组，空白组不做特殊处理，衰老组用0.3 mmol·L-1过氧化氢孵育60 min诱导肝细胞衰老[19]，白芍组在过氧化氢诱导肝细胞衰老后用CCK-8法筛选出的最佳浓度的白芍水煎液干预24 h，实验中注意加入相应体积的PBS为对照干预。

1.2.2 CCK-8法筛选白芍水煎液的最佳干预浓度 取白芍饮片(购自南京中医药大学附属医院)15 g，蒸馏水浸泡过夜，煎煮后旋蒸仪浓缩至15 mL，使药液1 mL相当于原生药1 g药材，过22 μm滤膜后用于干预肝细胞。肝细胞按每1×106mL-1密度预接种于96孔板，白芍水煎液梯度稀释为10、50、100、500 μg·mL-1和1、10、100 mg·mL-1，每组6个复孔，并设置对照孔、空白孔，干预24 h。检测时，每孔添加10 μL CCK-8试剂，孵育后于450 nm波长下读取OD值。计算细胞存活率并据此确定白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度。

1.2.3 外泌体的提取 超速离心法提取各组肝细胞外泌体。吸取各组肝细胞上清液，30 000 r/min离心15 min以去除细胞碎屑，随后移入超离管，PBS严格配平。10万g超速离心75 min，去除上清后于离心管底部收集沉淀物(即外泌体)，PBS复溶后保存于-80 ℃冰箱，备用。

1.2.4 透射电镜与粒径分析 取肝细胞外泌体重悬液滴至铜网，10 min后滤纸吸尽重悬液，2%磷钨酸染色2 min，再次吸尽液体后透射电镜拍照。粒径分析选用纳米颗粒跟踪分析系统检测肝细胞外泌体粒子的直径分布。外泌体重悬液稀释后用NanoSight NS300仪器进行外泌体粒径范围、质量浓度的测定。

1.2.5 小鼠软骨细胞原代培养及分组干预 脱颈法处死大鼠，开放膝关节腔。离断前后交差韧带后于胫骨平台处翻折取下软骨帽。洗净后粉碎至1 mm3，加入4% Ⅱ型胶原酶，于培养箱中(37℃、5%CO2)孵育2 h，终止消化后过滤、离心、重悬、种皿，含10%胎牛血清的DMEM培养。满皿后正常传代，将3～5代的软骨细胞用于后续实验。用5 μg·mL-1的LPS干预软骨细胞12 h以模拟KOA的炎症微环境，将各组肝细胞上清中所收集的外泌体分别用于干预LPS致炎的软骨细胞，并相应的标记为空白组、衰老组、白芍组。

1.2.6 ELISA检测 收集LPS干预前后的软骨细胞上清，按照ELISA试剂盒说明检测细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量。配合抗体稀释液和标准品稀释液建立标曲并完成加样，覆膜孵育30 min，洗涤后加入酶标试剂，覆膜孵育30 min，洗涤后加入显色液、终止液，酶标仪检测OD450值，对照标准品曲线计算样品浓度用于统计学分析。

1.2.7 PHK67荧光标记 将PHK荧光指示剂调至工作浓度25 μg·mL-1，加入复溶于PBS的外泌体中染色15 min，1% BSA终止染色。随后按前述方法重新收集染色后的外泌体，并加入预接种于6孔板的软骨细胞，培养箱孵育4 h，洗涤后4%多聚甲醛固定10 min，DAPI染核后荧光显微镜观察摄片。

1.2.8 qPCR检测 检测肝细胞中衰老相关基因p16、p21、p53，及软骨细胞中合成降解相关基因MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的mRNA表达。采用RNA快速提取试剂盒于无RNA酶环境下提取细胞总RNA。分光光度法测定RNA的浓度并按照逆转录试剂盒说明配平逆转录上样量，DEPC水补齐至20 μL。混匀离心后按扩增试剂盒说明书所需条件PCR仪扩增。各目的基因经GenBank检索序列，后用Oligo v6.6软件设计引物，上海生物工程技术服务有限公司帮助合成。目的基因及内参基因GAPDH序列见表1。以2-ΔΔCt计算目的基因的相对表达量。

表1 目的基因序列

1.2.9 Western blot RIPA冰上裂解，离心后BCA法测定蛋白浓度并配平加样量。依次执行电泳、湿转、5%脱脂奶粉室温封闭2 h、一抗室温孵育2 h、二抗室温孵育2 h，最后显色液曝光。测定条带灰度值后以GAPDH为内参半定量计算，用于统计学分析。

2 结果

2.1 白芍缓解过氧化氢诱导的肝细胞衰老

首先，采用CCK-8法验证白芍水煎液对肝细胞的细胞毒性(图1A)，结果显示：10、50、100 μg·mL-1的白芍水煎液对肝细胞存活率没有明显影响，而500 μg·mL-1及1、10、100 mg·mL-1将造成肝细胞存活率的降低(P<0.05，P<0.01)，故而选定100 μg·mL-1为白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度。随后用0.3 mmol·L-1过氧化氢诱导肝细胞衰老并观察白芍水煎液的干预效应，检测肝细胞中衰老相关基因p16、p21、p53的mRNA及蛋白表达水平(图1B～D)，结果显示：p16、p21、p53的基因和蛋白相对表达在衰老组均高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.01)；白芍组较衰老组降低，差异具有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。

注:A.不同剂量的白芍水煎液对肝细胞存活率的影响，与10 μg·mL-1比较，*P<0.05，**P<0.01。B.各组肝细胞衰老相关基因p16、p21、p53的mRNA表达水平，与空白组比较，**P<0.01;与衰老组比较,#P<0.05，##P<0.01。C.各组肝细胞衰老相关基因p16、p21、p53的代表性蛋白条带。D.各组肝细胞衰老相关基因p16、p21、p53的蛋白表达水平，与空白组比较，**P<0.01；与衰老组比较，#P<0.05，##P<0.01。

图1 白芍缓解H2O2诱导的肝细胞衰老

2.2 肝细胞外泌体的鉴定

以空白组外泌体为代表，通过透射电镜观察所收集外泌体，并进行粒径分析(图2A～B)，结果显示：各组外泌体均呈现双层膜结构，形态大小无差异；粒径富集均满足40～120 nm区间，代表性粒径富集于116.8 nm，丰度98%。以空白组外泌体为代表，选用提取外泌体后的肝细胞作为对照，检测外泌体标记物四旋蛋白CD9、CD63、CD81的表达情况，均为阳性表达(图2C)。

注：A.肝细胞外泌体代表性电镜观察；B.肝细胞外泌体代表性粒径分析；C.肝细胞外泌体标记物四旋蛋白CD9、CD63、CD81的表达

图2 肝细胞外泌体的鉴定

2.3 不同干预下的肝细胞外泌体对LPS致炎软骨细胞的影响

ELISA法检测软骨细胞上清液中TNF-α、IL-1β的含量以确定LPS成功构建模拟KOA炎症环境的细胞模型(图3)，结果显示与空白组比较，LPS干预后细胞上清液中TNF-α、IL-1β含量明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01)。随后用PHK67荧光指示剂观察LPS软骨细胞对各组肝细胞外泌体的摄入(图4)，结果显示：各组外泌体均被LPS软骨细胞摄入，荧光强度无差异。随后用空白组、衰老组、白芍组收集的肝细胞外泌体分别干预LPS致炎的软骨细胞，检测软骨细胞中合成降解相关基因MMP3、MMP13、SOX9、ADAMTS5的mRNA和蛋白表达水平(图5～6)，结果显示：MMP3、MMP13、ADAMTS5基因和蛋白相对表达在衰老组均高于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；白芍组较衰老组降低，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)。SOX9的基因和蛋白相对表达在衰老组均低于空白组，差异具有统计学意义(P<0.05，P<0.01)；白芍组较衰老组升高，差异具有统计学意义(P<0.05)。

注：与空白组比较,**P<0.01。

注：×200，标尺=500 μm。绿色荧光为PKH67染色后的 肝细胞外泌体；蓝色荧光为DAPI染色的细胞核。

图4 软骨细胞摄入肝细胞外泌体代表性荧光图

3 讨论

膝骨关节炎(Knee osteoarthritis，KOA)具有高发病率和致残率，但目前对其发病机制的研究并未取得实质进展，具体发病机制仍未明确。软骨破坏是KOA病程的核心环节，一旦软骨破坏开始，这一病理进程往往很难刹车，且进展较快。但随着对KOA发病特点以及治疗后情况观察的不断深入，对其认识也在逐步深入。如既往很长一段时期将KOA视作运动系统单一受累的疾病，近年来逐步提出其与代谢、免疫、内分泌等多个系统存在紧密关联。其中软骨退变作为一类衰老表现，其本身代谢紊乱与全身其他组织器官的代谢紊乱之间是否存在联系，我们认为这是切入KOA治疗的一个重要契机。肝细胞是人体最大代谢器官，肝实质细胞的衰老是否对软骨代谢产生影响，中医“柔肝养筋”治法能否在此环节产生良性效应及其潜在机制，这是本次研究的重点。

外泌体近年在细胞、组织间通讯中的作用成为研究者非常感兴趣的话题。多种细胞来源的外泌体被证实对KOA软骨细胞有影响。如Qi等研究了间充质干细胞来源外泌体对KOA软骨细胞活力的影响，证实间充质干细胞分泌外泌体能提高KOA软骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平，减少线粒体功能障碍，进而抑制KOA软骨细胞凋亡[20]。Wu等的研究证实髌下脂肪垫来源的间充质干细胞的外泌体能提高KOA软骨细胞Ⅱ型胶原的转录，下调MMP13、ADAMTS5的表达，对KOA有软骨保护效应[21]。本研究针对肝细胞衰老是否能通过外泌体的分泌对KOA软骨产生影响，以及经典的“柔肝养筋”要药白芍是否对此环节产生干预，设计了两部分实验进行论证。

注：与空白组比较,*P<0.05，**P<0.01；与衰老组比较， #P<0.05，##P<0.01。

注：与空白组比较,**P<0.01；与衰老组比较，#P<0.05，##P<0.01。

首先是利用过氧化氢诱导小鼠原代肝细胞衰老模型，观察白芍水煎液对肝衰老表型的干预效应。经CCK-8法筛选，100 μg·mL-1为白芍水煎液干预肝细胞的最佳浓度。研究结果表明，白芍水煎液能减少肝细胞衰老表型标记物p16、p21、p53的基因和蛋白表达水平，提示白芍水煎液能够缓解肝细胞衰老。随后，为进一步研究肝细胞衰老是否能通过外泌体的分泌对KOA软骨产生影响，以及白芍水煎液是否对此环节形成良性干预，采用LPS刺激软骨细胞模拟KOA炎症环境，并分别执行超速离心收集正常肝细胞分泌外泌体、衰老表型肝细胞外泌体、白芍水煎液干预下的衰老表型肝细胞外泌体。将所提取的各组外泌体分别作用于LPS致炎软骨细胞，结果显示：衰老表型的肝细胞外泌体增加LPS致炎软骨细胞中基质降解相关细胞因子MMP3、MMP13、ADAMTS5的表达水平，降低SOX9的表达水平，经白芍水煎液干预的衰老表型肝细胞外泌体则可显著改善这一结果。这样的结果验证了我们有关肝细胞衰老通过外泌体的分泌促使KOA软骨发生退变，经典的柔肝养筋要药白芍是否对此环节存在良性干预的科学假说。

我们认为，本研究中不同组别的外泌体主要区别于囊泡内容物，如微小RNA、蛋白、脂质等生物活性物质，它们通过激活靶细胞不同的信号通路产生作用，而白芍很可能改变了肝细胞衰老表型，进而使其外泌体所携带的生物活性物质发生种属、数量的改变，从而影响软骨细胞在炎症刺激下的代谢平衡。下一步，我们将针对外泌体中包含多种可携带生物信息的活性物质，对肝细胞外泌体作用于软骨细胞的具体物质做出鉴定，并结合体内实验和临床样本采集，对我们的研究结果进一步论证。