腺苷介导循环机械按压内关对心肌缺血大鼠的保护效应

徐森磊,顾任钧,杨雪莹,卞向宇,徐忻,夏雪峰,孙珂,吴嘉宏,刘雨晨,卢圣锋,3,张宏如,4,顾一煌

(1.南京中医药大学针灸推拿学院·养生康复学院,江苏 南京 210023;2.南京中医药大学第二附属医院/江苏省第二中医院,江苏 南京 210027;3.南京中医药大学针药结合教育部重点实验室,江苏 南京 210023;4.南京中医药大学中医学院·中西医结合学院,江苏 南京 210023)

心肌梗死(Myocardial infarction,MI)被定义为心肌组织的突然缺血性死亡,是世界范围内死亡和致残的主要原因[1]。据统计,我国心血管疾病流行趋势显著,发病人数增加,患病率及死亡率仍处于上升阶段,严重危害人民健康[2]。远端缺血处理(Remote ischemic conditioning,RIC)是使用血压袖带反复充气/放气来对不同的远端组织(如上肢)进行短暂、可逆的缺血缺氧刺激。多项研究表明RIC能够触发系统性反应,产生心肌保护效应[3-4]。RIC的机制研究是当前热点,多关注于血管闭塞复流引起的周围感觉神经活化和心肌保护因子释放,然而多项研究表明一过性缺血并不是触发心肌保护效应的必要条件[3]。事实上,RIC是一种结合了血管阻断和组织按压的复合刺激[5]。考虑到不同的远端刺激(机械、化学及电刺激)均可有效保护心脏[6],有理由将RIC中的组织按压与血管阻断因素相分离,单独研究该种机械刺激对心脏的远端保护效应。

脏腑经络学说经过长期的临床实践和理论演绎,将人体各部分联系起来,形成一个整体,即“内属脏腑,外络肢节”[7]。具体而言,属心包经络穴的内关,主治心、心包络等疾病,常用于治疗心血管疾病,素有“心胸内关谋”之说。课题组前期研究也表明电针内关穴3 d可有效缓解心肌缺血损伤[8]。从中医角度来看,多种刺激产生的远端心肌保护效应可归因于脏腑经络学说。考虑到RIC多作用于上臂等远端组织[6],本实验结合经络学说在心肌缺血后使用循环机械按压内关穴,探讨机械刺激的心肌保护效应及其相关机制,以完善RIC的机制研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

成年雄性SPF级SD大鼠18只,体质量260～280 g,由浙江维通利华实验动物技术有限公司提供,动物生产许可证号:SCXK(浙)2019-0001。大鼠适应性喂养1周,自由饮食,昼夜节律12 h/12 h,环境温度(25±2)℃,相对湿度(50±5)%。采用随机数表法将大鼠分为假手术组、模型组和机械刺激组(Mechanical stimuli),每组6只。实验过程中对动物的处理遵守中华人民共和国科技部2006年颁布的《关于善待实验动物的指导性意见》的规定，通过南京中医药大学动物伦理委员会批准，伦理号:202005A030。

1.2 主要仪器和试剂

小动物呼吸机(深圳瑞沃德生命科技有限公司),Powerlab电生理记录仪(澳大利亚AD Instruments公司),BX51T-PHD-J11显微镜(日本Olympus公司),RM2016病理切片机(德国Leica公司),台式高速冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂),DSHZ-300型恒温水浴箱(江苏太仓医用仪器厂),MIR-153型干燥箱(日本Sanyo公司),酶标仪(美国Biotek公司),可调压力机械按压仪器(自制)。异氟烷麻醉剂(深圳市瑞沃德生命科技有限公司),IL-1β、IL-6和TNF-α抗体(美国Affinity公司，货号：AF5103，DF6087，AF7014),β-actin(美国Sigma公司，货号：ABT264),大鼠腺苷ELISA试剂盒(南京金益柏生物科技有限公司，货号：JEB-17692),腺苷脱氨酶(ADA)一抗(英国Abcam公司，货号：ab175310),兔二抗(北京中杉金桥生物科技有限公司，货号：sp-9001),DAB显色剂(北京中杉金桥生物科技有限公司，货号：ZLI-9032)。

1.3 造模方法

模型组和机械刺激组采用冠状动脉左前降支(LAD)结扎术构建大鼠心肌缺血模型:术前大鼠禁食12 h,饮水自由。5%异氟烷+纯氧诱导麻醉后,以2%浓度维持,将大鼠仰卧固定在(37±3)℃的实验板上,插入气管后连接动物呼吸机(频率50～60次·min-1,潮气量2.0 mL)。接Powerlab电生理记录仪,标准Ⅱ导联检测心电图。剔除胸前及腋下毛发并用碘伏消毒,从第4～5肋间打开胸腔,充分暴露心脏,并于左心耳下撕开心包,迅速挤出心脏。持针器持取无菌6-0带线缝合针于左心耳下缘2 mm处进针,缝线穿过LAD并完全阻断其血流。结扎线以下心肌缺血发绀,心电图ST断弓背上抬,T波高耸表明缺血形成。结扎完成后,6-0缝线缝合胸腔开口,抽出空气,再由内向外逐层缝合肌肉和皮肤。术后观察大鼠状态,待苏醒将其从呼吸机上取下气管插管,正常饲养。假手术组仅从LAD下方穿线但不结扎,关闭胸腔。

1.4 干预方式

机械刺激组在LAD结扎术后第2天开始对大鼠进行3 d的循环机械按压干预。操作:1%～2%异氟烷维持麻醉,内关穴定位参照《实验针灸学》[9],采用自制仪器按压内关,按压面为直径3 mm圆形硅胶头,力度为150g,按压方式为按压5 min,放松5 min,3次循环为1组,每天干预1次,连续3 d。假手术组和模型组只接受相同时间和方式的抓取、固定和麻醉,不接受机械按压。

1.5 观察指标及检测方法

1.5.1 心脏TTC染色及心肌梗死面积测定 机械刺激3 d后,实验大鼠开胸迅速摘取心脏,并用PBS冲洗干净残血,-80 ℃冰冻30 min,自心尖向LAD结扎方向沿心脏横切面将心脏切为1 mm薄片,置于10 mL的1%三苯基氯化四氮唑(TTC)PBS溶液中,37 ℃孵育10 min,然后将心脏切片置于多聚甲醛中固定,过夜后拍照。在心脏切片上白色区域为梗死区,红色区域为健康区,使用Image J图像分析软件测定各区域面积,以计算心肌梗死区占心脏切片总横截面的百分比。

1.5.2 超声心动图检测左室射血分数 造模6 h及循环机械刺激3 d后分别使用ESAOTE多普勒超声仪对各组大鼠作经胸超声心动图检查。2%异氟烷维持麻醉,剃毛刀和脱毛膏去除大鼠胸前毛发。取胸骨长轴切面,应用M型记录左心室运动情况,测量左室舒张末期内径(LVEDD)和左室收缩末期内径(LVESD),计算左心室射血分数(LVEF)。

1.5.3 Western blot法检测大鼠心肌中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达 机械刺激3 d后,取左心室结扎线以下缺血心肌组织,提取总蛋白,每孔蛋白上样量为40 μg,经SDS-PAGE、电泳分离、转膜、蛋白印记、化学发光试剂显色,于凝胶成像系统中对条带进行成像与分析。

1.5.4 ELISA法检测大鼠血清腺苷浓度 机械刺激3 d后,经大鼠腹主动脉取血,离心后取上层血清,ELISA法检测血清中的腺苷浓度。

1.5.5 免疫组化(IHC)SP法检测穴区ADA表达情况 机械刺激3 d后,剪下大鼠内关穴区皮肤,用磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗后置于多聚甲醛溶液中固定。石蜡切片脱蜡入水,修复并消除内源性过氧化物酶,PBS冲洗后,加入一抗,4 ℃过夜,PBS冲洗表面杂质和一抗;加入生物素化二抗,37 ℃孵育20 min,PBS清洗;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液,37 ℃孵育20 min,PBS清洗;DAB显色、复染并封片,在显微镜下观察。采用免疫组化评分(HIS)[10]以分析免疫组化结果,对阳性细胞显色强度分级:0(阴性)、1(弱阳性)、2(阳性)、3(强阳性),阳性细胞数进行评分:1～4分为0～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%;分数相乘,再进行比较。

1.6 统计学处理

2 结果

2.1 心肌缺血大鼠造模前后心电图改变

结扎大鼠LAD段后同步检测大鼠Ⅱ导联心电图,可见心电图ST段弓背上抬,T波高耸,此为心肌缺血形成标志,表明造模成功。见图1。

图1 造模前后大鼠心电图Ⅱ导联比较

2.2 各组大鼠心肌梗死面积比较

机械刺激3 d后,假手术组无心机梗死;与假手术组相比,模型组心肌梗死面积显著增大(P<0.000 1);与模型组相比,机械刺激组梗死面积显著减少(P<0.001)。见图2。

2.3 各组大鼠LVEF比较

造模6 h后,各组间LVEF比较没有差异(P>0.05)。机械刺激后3 d,模型组大鼠心脏LVEF值为(46.67±4.23)%,显著低于假手术组(89.00±5.62)%(P<0.000 1);机械刺激组大鼠心脏LVEF值为(68.17±5.78)%,显著高于模型组(P<0.000 1)。见图3。

注:与模型组比较,图2 各组大鼠心肌梗死面积百分比的比较

2.4 各组大鼠心肌中炎症因子的表达水平比较

机械刺激后3 d,与假手术组相比,模型组大鼠心肌中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达明显增高(P<0.000 1);与模型组相比,机械刺激显著降低了大鼠心肌中炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达(P<0.000 1)。见图4。

2.5 各组大鼠血清中腺苷的表达水平比较

机械刺激后3 d,与假手术组相比,模型组大鼠血清中的腺苷表达差异没有统计学意义(P>0.05);与模型组相比,机械刺激组大鼠血清中腺苷表达水平显著增加(P<0.01)。见图5。

2.6 各组大鼠内关穴区皮肤中ADA的表达水平比较

造模后3 d,与假手术组相比,模型组大鼠内关穴皮肤中ADA的表达差异没有统计学意义(P>0.05);与模型组相比,机械刺激组大鼠内关穴皮肤中ADA的表达显著降低(P<0.01)。见图6。

3 讨论

RIC起源自一项数学模型,最初仅限于冠状动脉血管床局部的缺血预处理,推测其能释放某种保护因子[11],可被用来缓解心肌缺血再灌注损伤,除此之外还适用于心源性休克和严重的心律失常[3]。后来逐渐发现,不论是空间上的心肌近端和远端组织缺血处理,抑或是时间上的缺血预处理和后处理,均具有心肌保护效应[3]。数十个实验室均重复了RIC的心肌保护功能,发现其能改善MI后的心脏重构和血管新生[12];并且多项临床试验揭示了RIC可减少MI面积的大小,并改善临床结局[13]。

注:与模型组比较,图3 各组大鼠超声心动图及射血分数比较

如前所述,RIC是由短暂的缺血刺激所引起的;然而一些体内外实验表明,短暂性缺血或血流中断并不是远端心肌保护效应的必要触发条件[3]。深入分析RIC其实是一种结合了血管阻断和组织按压的复合刺激[5];考虑到多种替代因素(电、化学及机械刺激[14-16]等)均能触发心肌保护效应,我们将机械按压与血管阻断因素分离,单独研究其在远端心肌保护效应中的作用。同时,RIC常通过血管袖带处理上肢产生远端心肌保护效应[6],从中医角度来看可纳入“内属脏腑,外络肢节”的经穴脏腑相关学说。具体而言,内关位于上肢,属手厥阴心包经络穴,与阴维脉相通,主治心血管疾患,素有“心胸内关谋”之说[7]。课题组前期研究也表明电针内关穴3 d可有效缓解心肌缺血损伤[8]。因此,本研究通过循环机械按压内关穴来处理心肌缺血大鼠,结果表明该介入手段显著降低了急性心肌缺血大鼠的心脏梗死面积。本实验还通过超声心动图测算EF来评价心功能:心肌收缩力越强,每搏输出量越多,EF值也越大。经过3 d循环机械按压内关,显著改善了LVEF值,表明该介入手段具有稳定的抗心肌缺血损伤的功能。

注:与模型组比较,图5 各组大鼠血清中腺苷的表达水平比较

注:与模型组比较,图6 各组大鼠内关穴区皮肤中ADA 表达水平比较

相关研究表明腺苷是RIC中重要的触发因素,也是信号转导的体液因子,其释放能够产生心肌保护作用[5,17]。具体来看,本研究发现电、化学和机械等刺激的共同特点是均活化了周围感觉神经;而以一定剂量的腺苷可直接活化局部感觉神经,减少啮齿类动物的MI面积[18]。更直接的证据指出,MI面积的减少与动脉血浆以及脊柱组织中的腺苷含量有关[19-20],而使用腺苷受体阻滞剂可以废除该保护效应,提示腺苷能促进RIC心肌保护效应的体液转移[21]。此外,心肌缺血后的炎症反应程度与其预后密切相关,相关研究表明腺苷可通过下调炎症反应来促进组织的损伤修复[22]。本次实验发现机械刺激组大鼠血清中腺苷的表达水平显著增加,表明腺苷与机械刺激的心肌保护效应密切相关;同时发现心肌中炎症相关细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表达显著降低,指出腺苷的心肌保护效应或是通过下调心肌缺血后的炎症反应达成的。

腺苷是三磷酸腺苷(ATP)的天然分解产物,广泛存在于所有组织和体液中。Goldman等指出非对抗疗法如整脊和推拿,涉及对关节和肌肉的机械操作,可能与细胞内ATP的流出有关,这足以提升细胞外的腺苷含量[23]。基础情况下细胞外腺苷的浓度是恒定的,若是细胞外腺苷水平过高,其会被转运至细胞内,并被ADA降解为腺苷;而抑制ADA会引起腺苷释放增加[24]。本实验发现机械刺激组显著降低了大鼠内关穴皮肤中ADA的表达,提示ADA的表达降低或是机械刺激增加动脉中腺苷水平的相关原因。

综上所述,循环机械按压内关穴可减少心肌缺血损伤大鼠的梗死面积,改善心功能;其机制或与机械刺激抑制穴区ADA表达,限制腺苷降解,提高动脉中的腺苷浓度有关。外源性腺苷水平的增加能够缓和促炎细胞因子的释放和氧化介导的组织损伤;并且抑制ADA能够平衡炎性反应,而非完全抑制,从而保留有稳健的免疫反应,均有利于保护缺血损伤的心肌[25]。此外,除了腺苷等体液因素外,内关还和心脏存在以同一神经阶段为基础的“内关-心脏联系的短反射”,该种神经联系是否也与机械刺激内关穴产生心肌保护效应的机制相关,均需要进一步研究。