超声波辅助异抗坏血酸处理对贮藏期鲜切苹果的护色作用

贾 玉，张 芳，王梦茹，王雪莹，李国琴，额日赫木

（山西师范大学食品科学学院，山西 临汾 041004）

苹果富含微量元素、碳水化合物、维生素等多种人体所需的营养成分，是公认的营养程度较高的水果之一。随着人们生活水平的提高，生活方式与消费观念的改变，苹果的加工方式和消费形式也有了新的变化[1-3]。鲜切苹果是经轻度加工的新式产品，具有新鲜、方便、营养、无公害等特点，深受消费者喜爱[4-5]。然而在去皮、切割等过程中，鲜切苹果细胞组织内的酚类化合物与多酚氧化酶（Polyphenol oxidase,PPO）直接接触，逐渐发生氧化褐变，从而严重影响了鲜切产品的感官品质及营养价值。因此，提高鲜切产品品质和延长货架期，是目前其在加工和贮藏过程中面临的主要问题之一[6-7]。

异抗坏血酸（Erythorbicacid,EA）是抗坏血酸的异构体，在化学性质上与其相似，是一种新型且安全的食品保鲜剂，且抗氧化性能优于抗坏血酸[8-9]。袁芳等[8]研究了EA和氯化钙联合处理对鲜切芒果保鲜效果的影响，结果表明：1.0%EA处理可以使鲜切芒果保持较好的贮藏品质。陈凤美[9]研究了不同浓度EA处理对灰树花子实体采后品质的影响，结果表明：在4℃贮藏期内（0～27 d），0.1%EA处理维持了较高的超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）、过氧化氢酶（Catalase,CAT）及过氧化物酶（Peroxidase,POD）活性，延缓了丙二醛（Malondialdehyde,MDA）含量的上升，并通过降低PPO活性抑制了其褐变。超声波（Ultrasound,US）作为非热物理技术被广泛应用于食品行业各领域中[10-12]。它与传统的热加工和化学加工技术相比，可避免食品中残留化学物质对人体的负面影响，能更好地保持食品原有风味。近年，由于US在鲜切果蔬护色保鲜方面也取得了不错的效果，因而备受业内人士的关注[13]。杨明冠等[14]的研究表明，US处理（30℃，600 W，90 min）可以显著钝化鲜切苹果的PPO活性，在一定的US处理时间内，其PPO活性随着US功率的增大而降低，有效降低了贮藏期鲜切苹果的褐变。潘艳芳等[15]的研究表明，鲜切甘薯经40 kHz US处理10 min后，显著抑制了其PPO和POD活性的上升，延缓了贮藏期鲜切甘薯的褐变。杨明冠等[16]的研究表明，鲜切马铃薯经600 W US处理90 min后，其PPO活性得到了显著抑制，与未处理样品比较，其PPO活性降低了45.79%。由此可见，EA和US在鲜切果蔬护色保鲜方面已拥有良好的应用基础。但目前就US辅助EA处理对鲜切苹果护色保鲜的相关研究还尚未见报道。

本研究利用US辅助EA（US-EA）处理鲜切苹果，考察其对贮藏期鲜切苹果褐变指数（Browning index,BI）、PPO、POD、苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase,PAL）活性、多酚和MDA含量等相关指标的影响，系统分析US-EA处理对鲜切苹果的护色作用，以期为鲜切苹果护色保鲜研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

红富士苹果，购于临汾市尧丰市场，挑选大小均一、色泽均匀、无损伤的新鲜果实，于4℃、相对湿度为90%条件下贮藏，备用。

异抗坏血酸（食品级），深圳乐芙生物科技有限公司产品；L-苯丙氨酸，上海阿拉丁生化科技股份有限公司产品；福林酚，上海源叶有限公司产品；邻苯二酚，南京化学试剂股份有限公司产品；愈创木酚、硼砂，天津市光复科技发展有限公司产品；聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）、硼酸、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、碳酸钠，均为天津市科密欧有限公司产品。以上化学试剂均为分析纯。

1.1.2 仪器与设备

NR110型色差计，三恩时科技有限公司；LC-Q01型切片机，佛山市顺德区韩泰电器有限公司；KQ300E型超声波清洗器（40 kHz频率），昆山市超声仪器有限公司；752型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司；PHS-25型数显pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 鲜切苹果的护色处理

苹果清洗后切成厚度3 mm、直径20 mm的鲜切苹果片，备用。

US处理：鲜切苹果置于US清洗槽内（内含3 000 mL蒸馏水），在40 kHz、300 W的US功率下处理2.5 min。

EA处理：将鲜切苹果置于3 000 mL EA溶液（0.5 g/L）中浸泡2.5 min。

US-EA处理：将鲜切苹果置于US清洗槽内，加入3 000 mL EA溶液（0.5 g/L），在40 kHz、300 W的US功率下处理2.5 min。

以无任何处理的鲜切苹果作为对照（CK），考察上述3种处理方式对鲜切苹果的护色效果。将处理后的鲜切样品于4℃贮藏1 h，以ΔBI值为指标筛选出最佳的护色处理方式。

1.2.2 鲜切苹果的贮藏

将对照组和US-EA处理组鲜切苹果分别用聚乙烯保鲜膜（厚度0.01 mm，宽40 cm）包好，置于4℃、相对湿度为90%条件下贮藏96 h，每24 h取1次样，检测其在贮藏期内各项生理生化指标的变化。

1.2.3 测定项目与方法

1.2.3.1 总色差值（ΔE）和BI值

1.2.3.2 PPO、POD活性

参考Zhang等[18]的方法，并稍有修改。称取5 g鲜切苹果样品，加入10 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液（pH 6.5），冰浴研磨，4℃低温条件下10 000 r/min离心15 min，得到上清液，即粗酶液。

PPO活性的测定：依次取2.5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 5.5），1 mL 0.2 mol/L邻苯二酚溶液及1 mL粗酶液，混匀后测定其在410 nm处的吸光值。每30 s记录1次，共记录3 min。以1 mL磷酸缓冲溶液代替粗酶液作为空白对照。酶活性的定义为：以每分钟反应体系吸光值增加0.01为1个酶活性单位（U）。

POD活性的测定：依次取2.5 mL 0.1 mol/L磷酸缓冲溶液（pH 5.5），1 mL 0.02 mol/L愈创木酚溶液及2 mL 0.02 mol/L H2O2混匀，再加入1 mL酶液摇匀，在470 nm处测定其吸光值，每30 s记录1次，共记录3 min。以1 mL磷酸缓冲溶液代替粗酶液作为空白对照。酶活性的定义为：以每分钟反应体系吸光值增加0.01为1个酶活性单位（U）。

1.2.3.3 PAL活性

参照Liu等[19]的方法测定，略有改动。称取5 g样品，加入10 mLPAL提取剂，冰浴研磨，4℃下10 000 r/min离心30 min，得到上清液（样液），备用。分别取3 mL H3BO3缓冲溶液（50 mmol/L，pH 8.8）和0.5 mL 20 mmol/L的L-苯基丙胺酸溶液，摇匀，于37℃下水浴10 min，再加入0.5 mL样液，混匀，于290 nm处测定其吸光值。再将上述混合液在37℃下水浴1 h后在290 nm处测定其吸光值。以1 h内反应体系的A290变化0.01为PAL的一个活性单位（U）。

1.2.3.4 多酚含量

参照Piccolella等[20]的方法测定，略有修改。称取5 g样品，加入15 mL 80%（V/V）的乙醇溶液，冰浴研磨，4℃低温10 000 r/min离心15 min，取上清液为样液，备用。依次取0.3 mL样液、1.5 mL 0.25 mol/L福林酚试剂，混匀后放置3 min，再加入0.5 mL 20%（m/m）的碳酸钠溶液，于暗处反应1 h后在725 nm测定其吸光值。根据标准曲线计算鲜切苹果的多酚含量（mg·100 g-1FW）。

今天我看朋友圈，一条消息让我感动，源于一个普通人的出乎意外的举动——火车站卖票处，排着长长的队，一个女人乘坐的火车快要到点了，她走到排在第二位的男人面前，恳求让她先买票，那个男人让她进来，而他自己则走到队伍的最后面重新排队。原本，他可以让这个女人插号的，这样的话也已经算得上仁善，可是，他让给她位置，自己重新去排队。这，是教养！

1.2.3.5 MDA含量

参照Liu等[21]的方法测定，并有改动。称取5 g样品，加入10 mL 0.61 mol/L TCA提取液，研磨，4℃低温10 000 r/min离心20 min，取上清液，备用。依次取3 mL 0.6%TBA（m/m）溶液和3 mL的样液混匀，沸水水浴15 min。再将上述混合液4℃低温10 000 r/min离心15 min，并分别在450、532、600 nm处测定其吸光值，并计算MDA含量（mmol·g-1FW）。以3 mL 0.61 mol/L TCA溶液代替样液作为空白对照。

1.2.4 数据处理

试验所得数据均为3次重复，2次平行，结果以平均值±标准偏差的形式表示，采用Origin 2018软件绘图，采用IBM SPSS Statistics 20.0软件对数据进行统计学分析，采用Duncan多重比较法进行显著性分析。

2 结果与分析

2.1 最佳护色处理方式的筛选

如图1所示，单独的US处理和EA处理后，鲜切苹果的ΔE均显著低于对照组（P＜0.05），表明这两种处理方式均能显著抑制贮藏期（1 h）鲜切苹果的褐变，且EA处理明显优于US处理。鲜切苹果样品经US-EA复合处理后，其ΔE显著低于两种单独处理的鲜切苹果样品（P＜0.05），即ΔE分别降低了78.95%和59.49%。由此可见，在3种护色方式中，US-EA复合处理对鲜切苹果的护色效果最佳。

图1 不同处理对鲜切苹果ΔE的影响Fig.1 Effect of different treatment onΔE of fresh-cut apple

2.2 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果生理生化指标的影响

2.2.1 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果BI值的影响BI值能够直接反映鲜切苹果的褐变程度，BI值越大表明褐变越严重[17]。由图2可知，在贮藏0～96 h内，US-EA处理组和对照组鲜切苹果的BI值均呈上升趋势，但US-EA处理组的BI值均显著低于同期的对照组（P＜0.05）。特别是在贮藏24 h时，US-EA处理组BI值低于对照组57.36%，随后仍然保持较高的差异性。同时，由图3可知，从贮藏24 h开始，对照组鲜切苹果的外观颜色逐渐加深，而US-EA处理组颜色变化不明显，这证明US-EA处理可以有效抑制鲜切苹果的褐变，从而延长货架期。

图2 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果BI值的影响Fig.2 Effect of US-EA treatment on BI value of fresh-cut apple during storage

图3 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果外观色泽的影响Fig.3 Effect of US-EA treatment on exterior colour of fresh-cut apple during storage

2.2.2 US-EA处理对鲜切苹果PPO活性的影响

PPO是造成鲜切果蔬产品氧化褐变的关键因素之一。因此，抑制PPO活性对鲜切果蔬护色保鲜具有重要意义。由图4可知，在0～96 h贮藏期内，对照组和US-EA处理组鲜切苹果的PPO活性均呈上升趋势。但在贮藏72 h内，US-EA处理组PPO活性显著低于对照组（P＜0.05），而在贮藏96 h时无显著性差异。随着贮藏时间的延长（贮藏96 h），EA的自身氧化速率加快，导致抑制能力被削弱，进而导致鲜切苹果PPO活性上升。另外，一些学者认为US可以通过改变鲜切果蔬PPO分子空间结构而钝化或灭活其活性[22-23]，但随着贮藏时间的延长，PPO分子空间结构可能再次产生变化，继而促使其活性进一步上升。由此可见，US-EA复合处理能显著抑制贮藏期鲜切苹果的PPO活性。

图4 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果PPO活性的影响Fig.4 Effect of US-EA treatment on PPO activity of fresh-cut apple during storage

2.2.3 US-EA处理对鲜切苹果POD活性的影响

POD活性的升高会加剧鲜切果蔬的氧化变色，它是衡量鲜切果蔬衰老的重要指标之一[24]。由图5可知，在0～96 h贮藏期内，对照组和US-EA处理组鲜切苹果POD活性总体呈波动性上升趋势，特别是在贮藏48 h后上升幅度较大，但US-EA处理组POD活性（除48 h外）显著低于对照组（P＜0.05）。在贮藏96 h时，US-EA处理组与对照组比较，其POD活性仍低27.1%。这表明US-EA复合处理能显著降低贮藏期鲜切苹果的POD活性。POD在H2O2存在时可以氧化酚类物质生成醌类物质，进一步缩合可形成褐色的聚合物[25]。一般许多果蔬组织中POD活性都伴随机械性损伤而升高，但在贮藏期内，US-EA处理组与对照组比较其POD活性上升幅度较小。这可能与US有关，由于US产生瞬态空化作用，导致大量自由基的形成，高能量的自由基直接攻击POD分子结构发生变化，影响其活性中心结构，从而钝化其活性[26]。另外，也可能与EA极强的抗氧化性有关，EA的抗氧化作用可以防止活性氧蓄积，从而抑制POD活性的升高[9]。

图5 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果POD活性的影响Fig.5 Effect of US-EA treatment on POD activity of fresh-cut apple during storage

2.2.4 US-EA处理对鲜切苹果PAL活性的影响

PAL是苯丙烷代谢途径的关键限速酶，它能催化苯丙氨酸向酚类物质转变。由图6可知，在整个贮藏期内，对照组鲜切苹果PAL活性呈先下降后上升趋势，在贮藏48 h时，PAL活性最低，这可能与低温贮藏环境抑制PAL活性有关，而随着贮藏时间的延长，PAL活性大幅升高，这可能与机械性损伤诱导鲜切苹果PAL活性上升有关[27]。但在整个贮藏期内，US-EA处理组鲜切苹果PAL活性上升幅度较小，且始终低于同期对照组，说明US-EA处理显著抑制了贮藏期鲜切苹果的PAL活性，从而延缓酚类化合物的合成与积累。

图6 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果PAL活性的影响Fig.6 Effect of US-EA treatment on PAL activity of fresh-cut apple during storage

2.2.5 US-EA处理对鲜切苹果多酚含量的影响

由图7可知，在整个贮藏期内，对照组鲜切苹果多酚含量变化趋势较为复杂，在贮藏24 h和72 h时，与初值比较其多酚含量显著下降（P＜0.05），而在48 h和96 h时无显著变化。另外，US-EA处理组多酚含量在贮藏24 h时显著降低，随后趋于平稳，但与对照组比较，仍然保持了较高的多酚含量。EA是具有较高抗氧化活性的化合物，它可以将酶促褐变氧化中间产物醌还原为酚类物质，阻止醌类物进一步自发聚合形成色素物质[28]。同时，US可通过改变鲜切苹果PPO和POD的分子结构而降低其活性，从而减少酚类物质的进一步消耗。因此，这可能是造成US-EA处理组鲜切苹果多酚含量始终高于对照组的原因。

图7 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果多酚含量的影响Fig.7 Effect of US-EA treatment on polyphenol content of fresh-cut apple during storage

2.2.6 US-EA处理对鲜切苹果MDA含量的影响

由图8可知，US-EA处理组鲜切苹果MDA含量在贮藏0～72 h内呈小幅下降趋势，随后（72～96 h）略有上升。然而，对照组MDA含量在贮藏24 h和初值比较显著上升，并达到最大值，随后呈下降趋势。在正常情况下，植物体内的氧自由基处于产生与清除的动态平衡中，然而逆境条件下可以破坏自由基代谢的平衡而引起膜脂的过氧化反应[29]。EA作为一种抗氧化剂，可清除植物体内过量的自由基，从而可以抑制膜脂的过氧化反应。由此可见，在贮藏初期（24 h），US-EA处理显著降低了MDA的生成，减少了鲜切苹果细胞膜脂的氧化程度，降低了其氧化损伤，贮藏品质得到了有效保持。

图8 US-EA处理对贮藏期鲜切苹果MDA含量的影响Fig.8 Effect of US-EA treatment on MDA content of fresh-cut apple during storage

3 结论与讨论

在加工过程中，鲜切果蔬由于受到机械损伤而易发生氧化褐变，导致其感官品质和营养价值下降[5-7]。在正常情况下，植物细胞中的氧化酶类与酚类化合物是呈区域化分布的，因而不易发生酶促氧化。在鲜切加工过程中，植物细胞受损，原本区域化平衡被打破，酶与底物直接接触，在有氧的条件下发生酶促褐变[30-32]。目前，许多研究已证明PPO是鲜切果蔬发生酶促褐变的最关键的酶。POD也可在活性氧的参与下氧化酚类化合物而产生褐变。PAL可以催化果蔬中的苯丙氨酸合成酚类化合物[33-34]。在本研究中，根据ΔE可以看出，3种护色处理方式中US-EA处理对鲜切苹果的护色效果最好。在贮藏期内，根据BI值和表观颜色变化可以看出，US-EA处理对鲜切苹果的护色效果显著优于对照组样品。鲜切苹果经过US-EA处理后，在96 h的贮藏期内其PPO和POD活性均有不同程度的上升，但始终低于对照组鲜切苹果。这说明US-EA处理可能通过抑制氧化酶类活性而降低鲜切苹果的酶促褐变程度。另外，一些研究表明，在不同的处理方式或条件下，贮藏期内鲜切果蔬的PAL活性呈上升趋势[35-36]。在本研究中，经US-EA处理的鲜切苹果PAL活性在96 h的贮藏期内并未出现明显的升高，但始终低于对照组鲜切苹果样品。多酚是广泛存在于苹果中的次级代谢产物，并作为酶促褐变反应的重要底物，易发生氧化反应而生成醌类物质，进一步反应产生黄色、褐色至棕色的聚合物，引起苹果及其制品表观色泽的改变，它的积累和合成速率会影响鲜切果蔬的褐变程度[37]。在本研究中，鲜切苹果经US-EA处理后，在贮藏期内其多酚含量减少，但始终高于对照组鲜切苹果样品。有研究表明，鲜切果蔬的酶促褐变程度与多酚含量呈负相关，而与POD活性呈正相关[38]。鲜切苹果经US-EA处理后，可能通过EA的竞争性抑制作用和US对PPO或POD的空化作用，从而减少了酚类物质的进一步消耗。MDA是植物细胞膜脂过氧化产物，可作为由植物组织损伤引起膜脂过氧化程度的指标。MDA含量越低，表明植物细胞完整水平越好，即细胞壁或细胞膜的损伤越小[29]。在贮藏初期（24 h），US-EA处理显著抑制了MDA的生成，减少了鲜切苹果膜脂过氧化程度。综上所述，US-EA处理能有效降低PPO和POD活性，减少酚类物质的损失，降低MDA的生成，从而延缓贮藏期鲜切苹果的褐变。

近年，US在鲜切果蔬贮藏保鲜研究中得到了广泛应用。研究表明，在适当的条件下US可以降低鲜切果蔬氧化酶类如PPO、POD等的活性，从而延缓酶促褐变的发生。另外，US作为一项非热物理加工技术，与传统的食品加工技术比较，具有高效、节能、环保等优点。同时，在较短的处理时间内，US不会对鲜切果蔬的感官品质和营养价值造成不利影响，能较好地保持鲜切产品的原有品质[39-41]。

化学方法是多年来用于鲜切果蔬贮藏保鲜中最常见的一种方法，特别是随着食品添加剂行业的发展，各种化学合成的护色剂或保鲜剂相继用于鲜切果蔬贮藏保鲜中。但由于一些化学保鲜剂或护色剂的残留问题比较突出，鲜切果蔬的食用安全性一直饱受争议。EA是一种新型的、被公认安全性较高的化学保鲜剂，是抗坏血酸的一种立体异构体，具有较强的抗氧化能力，在鲜切果蔬护色保鲜中有着广泛的应用基础[8-9]。

在本研究中，以US辅助EA处理鲜切苹果，发挥了各自的优势，并在US-EA的协同作用下抑制了PPO活性，从而延缓了贮藏期鲜切苹果酶促褐变的发生。同时，US辅助EA的方法为鲜切果蔬贮藏保鲜研究提供了新的思路和参考数据。