西南冷凉高地鲜切马铃薯抗褐变研究

程立君，王世敏,*，李 周，程金朋，刘健君，余平莲

（1.昭通学院农学与生命科学学院，云南 昭通 657000；2.昭通市农业科学研究院，云南 昭通 657000）

马铃薯（Solanum tuberosum L.）是世界第四大粮食作物，富含维生素、矿物质、膳食纤维等成分，具有丰富的营养和良好的保健功能[1]。我国是世界马铃薯第一生产大国，种植面积和总产量均占全世界的20%左右[2]，目前形成了东北、华北、西北、南方和西南冷凉地区五大马铃薯主产区，其中西南冷凉地区因高海拔冷凉的气候环境和云贵高原得天独厚的红土资源，所产的马铃薯中淀粉和干物质含量高，质量较好[3]，适用于鲜食和加工。近年来，以马铃薯主粮化和产业扶贫为契机，西南地区马铃薯产业快速发展[4]，尤其是马铃薯主食化、鲜切等加工需求迅速增长，但是针对西南冷凉高地马铃薯的保鲜研究相对滞后。在马铃薯加工过程（如削皮、切片、粉碎）中，由于机械损伤导致代谢活动增强，氧化应激反应增加，同时组织暴露于空气表面与氧气接触，从而容易发生褐变[5]。鲜切马铃薯的褐变导致外观不佳、品质下降以及水分和养分的流失[6]，影响产品的生产和销售，并阻碍了深加工产品的进一步发展[7]。

鲜切马铃薯的褐变通常是由多酚氧化酶（PPO）引起的酶促褐变[8]。多酚氧化酶是一种含有两个铜原子（CuA）的3型铜蛋白，在分子氧存在下，PPO可催化单酚酶羟基化和邻二酚氧化为邻醌，随后醌类化合物被氧化成醌衍生物，形成的邻醌与其他醌、氨基酸、蛋白质非酶聚合形成黑色化合物，导致酶促褐变[9]，并且不同品种马铃薯的多酚氧化酶活性存在差异[10-11]。因此，如何有效抑制多酚氧化酶活性是西南冷凉高地鲜切马铃薯产业发展的迫切需要。

通过调节pH和温度等物理方法可以降低多酚氧化酶活性，从而控制马铃薯褐变的程度[12]，但是这些操作同时也容易导致马铃薯营养成分的损失。因此，本研究选择柠檬酸、L-半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠、氯化钙4种添加剂进行复配，在单因素试验的基础上，采用响应面法研究其不同比例复配后对鲜切马铃薯的护色效果，最终获得对鲜切马铃薯褐变抑制效果最佳的组合，为鲜切马铃薯的护色保鲜提供参考，以期为高原特色马铃薯产品的开发提供支持。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

试验用马铃薯品种为昭薯ZT032，由昭通市农业科学院提供。挑选新鲜、大小基本一致、无病虫害和机械损伤的马铃薯，4℃条件下贮存，备用。

磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、亚硫酸氢钠、氯化钙、邻苯二酚、柠檬酸、D-异抗坏血酸钠：均为国产分析纯；L-半胱氨酸：生化试剂。

1.1.2 仪器与设备

AX224ZH/E型精密电子天平，奥豪斯仪器有限公司；759型可见分光光度计，上海奥谱勒仪器有限公司；HL/T20MM型高速冷冻离心机，湖南赫西仪器装备有限公司；BGZ140型干燥箱，上海博讯实业有限公司医疗设备厂。

1.2 方法

1.2.1 单因素试验设计

1.2.1.1 柠檬酸对鲜切马铃薯护色的影响

新鲜马铃薯清洗、去皮后，切成厚度为3 mm的薄片，于浓度分别为0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%、0.8%的柠檬酸溶液中浸泡护色20 min后，考察其对马铃薯片PPO活性抑制率的影响。

1.2.1.2 L-半胱氨酸对鲜切马铃薯护色的影响

新鲜马铃薯清洗、去皮后，切成厚度为3 mm的薄片，于浓度分别为0.10%、0.15%、0.20%、0.25%、0.30%、0.35%、0.40%的L-半胱氨酸溶液中浸泡护色20 min后，考察其对马铃薯片PPO活性抑制率的影响。

1.2.1.3 D-异抗坏血酸钠对鲜切马铃薯护色的影响

新鲜马铃薯清洗、去皮后，切成厚度为3 mm的薄片，于浓度分别为0.01%、0.02%、0.03%、0.04%、0.05%、0.06%的D-异抗坏血酸钠溶液中浸泡护色20 min后，考察其对马铃薯片PPO活性抑制率的影响。

1.2.1.4 氯化钙对鲜切马铃薯护色的影响

新鲜马铃薯清洗、去皮后，切成厚度为3 mm的薄片，于浓度分别为0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%的氯化钙溶液中浸泡护色20 min后，考察其对马铃薯片PPO活性抑制率的影响。

1.2.2 响应面法优化鲜切马铃薯护色剂配方试验

在单因素试验的基础上，采用Box-Behnken响应面法优化柠檬酸、L-半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠和氯化钙配比，得到最优的马铃薯褐变抑制剂复合配方，并对该结果进行验证。

1.2.3 多酚氧化酶的提取及酶活性抑制率的测定

参考李利华[13]的方法，加以改进。称取不同处理后的马铃薯样品5 g，加入预冷的pH 6.0的磷酸缓冲溶液10 mL，在冰水浴中研磨成匀浆后，转入至25 mL容量瓶中，用已预冷的pH 6.0磷酸缓冲溶液定容至25 mL，混匀后4℃下浸提10 min，取出后以4℃、10 000 r/min离心30 min，离心后得到的上清液即为多酚氧化酶粗酶液。

参考李利华[13]的方法，采用比色法，取4℃冷藏的0.1 mol/L磷酸缓冲溶液4 mL及0.1 mol/L邻苯二酚溶液1.0 mL，再加入多酚氧化酶粗酶液0.5 mL，混匀后在波长420 nm处测定吸光值（OD值），从加入酶液开始计时，以不加酶液作为参比溶液每隔30 s记录1次OD值的变化。选取吸光度-时间曲线中线性部分确定反应时间和计算酶活性抑制率[14]。酶活性抑制率为经抑制剂处理后酶的催化活性下降的百分数[15]。

式中：IE为酶活性抑制率，%；ΔA0为未处理对照样品在反应时间内吸光度变化值；ΔA1为处理样品在反应时间内吸光度变化值。

1.2.4 数据处理

单因素试验结果采用SPSS（version 20.0）软件对试验数据进行处理和统计分析；响应面设计和数据分析采用Design Expert（version10.0）进行。

2 结果与分析

2.1 柠檬酸对鲜切马铃薯护色效果的影响

柠檬酸是一种重要的有机酸，因具有螯合作用和调节pH的特性，在食品加工中能提高抗氧剂的性能，抑制酶活性，延长食品保存期[16]。由图1可知，柠檬酸对PPO活性有明显的抑制效果。随着柠檬酸添加量的升高，对PPO活性的抑制率逐渐增加，当添加量达到0.5%时，酶活性抑制率达到62.03%，之后柠檬酸添加量继续升高，但PPO活性的抑制率基本保持稳定，这与刘丽等[17]的研究结果较一致。分析原因可能因为柠檬酸对PPO活性中心的铜离子具有较强的螯合作用，破坏了活性中心，使PPO活性受到抑制[18]，另外随着柠檬酸浓度的升高，溶液的pH值逐渐下降，使得反应体系的pH值远离PPO的最适pH值，进一步导致PPO的结构被破坏，从而失活[19]。但柠檬酸达到一定浓度后，反应底物也受到了柠檬酸的抑制，在同一时间也会对酶的活性中心进行竞争[20]，导致虽然浓度继续增加，但效果不明显。因此，试验选择柠檬酸浓度0.5%作为响应面Box-Benhnken设计中零水平的中心点。

图1 柠檬酸添加量对PPO活性抑制率的影响Fig.1 Effects of citric acid additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.2 L-半胱氨酸对鲜切马铃薯护色效果的影响

L-半胱氨酸为含硫氨基酸之一，属非必需氨基酸，能直接与酶促反应产物醌类物质结合生成无色的硫氢化合物，从而抑制褐变的发生[21]。由图2可见，L-半胱氨酸对PPO活性有明显的抑制作用，随着L-半胱氨酸添加量的升高，其对PPO活性的抑制率逐渐升高，当添加量达到0.25%时，酶活性抑制率达到61.10%；达到一定浓度后，继续增加L-半胱氨酸添加量，酶活性抑制率变化不明显。原因可是由于高浓度的L-半胱氨酸溶液在马铃薯组织中传质受阻，从而影响L-半胱氨酸向鲜切马铃薯的浸透[22-23]，L-半胱氨酸抑制鲜切马铃薯PPO活性的最佳添加量为0.25%。因此，选择L-半胱氨酸添加量0.25%作为响应面Box-Benhnken设计中零水平的中心点。

图2 L-半胱氨酸添加量对PPO活性抑制率的影响Fig.2 Effects of L-cysteine additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.3 D-异抗坏血酸钠对鲜切马铃薯护色效果的影响

D-异抗坏血酸钠又名赤藻糖酸钠，具有极强的还原性，是一种新型生物型食品抗氧防腐保鲜助色剂，能抑制果蔬氧化酶类的活性，防止褐变现象的发生，对保持果蔬的外观色泽和风味品质均有很大作用[24]。由图3可知，D-异抗坏血酸钠对鲜切马铃薯PPO活性有显著的抑制作用，因为D-异抗坏血酸钠能够作用于多酚氧化酶中心的铜离子，钝化酶活性，同时能还原被酚酶氧化的酚类物质，抑制褐变进程[25]。试验结果表明，随着D-异抗坏血酸钠添加量的升高，其对PPO活性的抑制率逐渐升高，当添加量达到0.04%时，酶活性抑制率达到77.26%，抑制效果明显。但当D-异抗坏血酸钠添加量超过0.04%后，酶活性抑制率变化不明显。因此，选择D-异抗坏血酸钠添加量0.04%作为响应面Box-Benhnken设计中零水平的中心点。

图3 D-异抗坏血酸钠添加量对PPO活性抑制率的影响Fig.3 Effects of D-sodium isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.4 氯化钙对鲜切马铃薯护色效果的影响

氯化钙常作为食品添加剂，能使可溶性果胶凝固为凝胶状不溶性果胶酸钙，保持果蔬加工制品的脆度和硬度，同时Ca2+能够抑制PPO活性，从而延缓褐变的发生[26-27]。由图4可知，氯化钙对鲜切马铃薯PPO活性具有一定的抑制作用，这可能是因为Ca2+与PPO中具有羧基的化合物结合，从而降低PPO活性[28]。随着氯化钙浓度的升高，对PPO活性的抑制率逐渐升高，当添加量达到0.6%时，抑制率为36.09%，抑制效果明显。当氯化钙添加量超过0.6%后，浓度继续升高，酶活性抑制率变化趋于平缓，单独使用氯化钙作抑制剂时效果并不十分理想，有必要与其他抑制剂同时使用，通过交互作用增加抑制效果。因此，本试验选择氯化钙添加量0.6%作为响应面Box-Benhnken设计中零水平的中心点。

图4 氯化钙添加量对PPO活性抑制率的影响Fig.4 Effects of calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

2.5 响应面法优化鲜切马铃薯护色剂配方试验结果

2.5.1 Box-Behnken设计与结果

根据单因素试验结果，利用Design Expert软件进行Box-Behnken响应面中心组合试验设计，以柠檬酸添加量、L-半胱氨酸添加量、D-异抗坏血酸钠添加量、氯化钙添加量4个因素为自变量，以PPO活性抑制率为响应值，进行四因素三水平响应面试验分析，优化褐变抑制剂的配方，响应面试验因素水平见表1，试验设计与结果见表2。

表1 响应面试验因素水平表Table 1 Factor and level of response surface experiment

表2 响应面试验设计及结果Table 2 Response surface experimental design and results

2.5.2 多元二次回归方程拟合及方差分析

利用Design Expert软件对表2试验结果进行多元二次回归方程拟合，通过响应面回归过程进行数据分析，建立回归模型，得到回归方程：

回归模型方差分析结果见表3。由表3可知，回归方程极显著（F=10.58，P＜0.000 1），失拟项不显著（P=0.279 8＞0.05），表明该模型有很好的拟合度，能将柠檬酸添加量、L-半胱氨酸添加量、D-异抗坏血酸钠添加量和氯化钙添加量4个因素对鲜切马铃薯护色效果进行准确的预测。方差分析结果表明：一次项B，交互项BC、BD，二次项A2、B2、D2对PPO活性抑制率的影响极显著（P＜0.01），一次项C对PPO活性抑制率的影响显著（P＜0.05），交互项AB、AC、AD对PPO活性抑制率的影响不显著；各因素对多酚氧化酶活性抑制率影响的顺序为：B（L-半胱氨酸添加量）＞C（D-异抗坏血酸钠添加量）＞D（氯化钙添加量）＞A（柠檬酸添加量）。

表3 响应面回归模型方差分析结果Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

2.5.3 响应曲面图分析

各因素交互作用对鲜切马铃薯PPO活性抑制率的影响见图5～10。每个响应曲面图代表两个自变量之间的相互作用对PPO活性抑制率的影响。通过对图5～10的分析可知，除了BC（图8）BD（图9）的响应面图陡峭，等高线呈椭圆形，表明其交互作用极显著（P＜0.01），其他两两因素交互作用的响应面图较平缓，等高线均呈椭圆形，随着柠檬酸、L-半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠和氯化钙水平的增加，酶活性抑制率变化均呈现先增加后下降的变化趋势，表明选择合适的柠檬酸、L-半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠和氯化钙添加量对抑制多酚氧化酶活性至关重要。

图5 柠檬酸和L-半胱氨酸添加量的交互作用对酶活性抑制率影响的响应面图Fig.5 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and L-cysteine additions on the inhibitory rates of PPO activities

图8 L-半胱氨酸和D-异抗坏血酸钠添加量的交互作用对酶活性抑制率影响的响应面图Fig.8 Response surface plot showing the interaction effects of L-cysteine and sodium D-isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

图9 L-半胱氨酸和氯化钙添加量的交互作用对酶活性抑制率影响的响应面图Fig.9 Response surface plot showing the interaction effects of L-cysteine additions and calcium chloride on the inhibitory rates of PPO activities

2.5.4 褐变抑制剂配比的确定

在获得非线性回归模型和响应面分析的基础上，得出酶活性抑制率的最佳条件为：柠檬酸添加量0.47%，L-半胱氨酸添加量0.28%，D-异抗坏血酸钠添加量0.05%，氯化钙添加量0.54%，该条件下酶活性抑制率预测值为95.84%。为验证模型预测的可靠性，在此最优配比条件下，进行3组平行验证试验。结果表明，酶活性抑制率的平均值为95.13%，与预测值相比，两者的相对误差为0.71%，误差较小，说明该模型可以很好地反映酶活性抑制率与各褐变抑制剂添加量的关系，利用响应面法优化褐变抑制剂添加量配比的研究是可靠的。

图6 柠檬酸和D-异抗坏血酸钠添加量的交互作用对酶活性抑制率影响的响应面图Fig.6 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and D-sodium isoascorbate additions on the inhibitory rates of PPO activities

图7 柠檬酸和氯化钙添加量的交互作用对酶活性抑制率影响的响应面图Fig.7 Response surface plot showing the interaction effects of citric acid and calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

图10 D-异抗坏血酸钠和氯化钙添加量的交互作用对酶活性抑制率影响的响应面图Fig.10 Response surface plot showing the interaction effects of sodium D-isoascorbate and calcium chloride additions on the inhibitory rates of PPO activities

3 结论

试验选择西南冷凉高地种植的马铃薯品种昭薯ZT032为护色试验品种，通过添加护色剂抑制鲜切马铃薯中多酚氧化酶活性，减少褐变发生。单因素试验中研究了单一柠檬酸、L-半胱氨酸、D-异抗坏血酸钠和氯化钙对鲜切马铃薯的护色效果，并在此基础上采用响应面法进行复配研究。结果发现，复合护色剂对多酚氧化酶的酶活性抑制率效果优于单一护色剂的效果。采用响应面优化试验得到西南冷凉高地鲜切马铃薯护色剂的最佳添加量配比为：柠檬酸0.47%，L-半胱氨酸0.28%，D-异抗坏血酸钠0.05%，氯化钙0.54%，此时PPO的酶活性抑制率为95.13%，与模型预测值的相对误差仅为0.71%。该研究对高原特色鲜切马铃薯等产品的开发具有一定的应用价值。