中强度脉冲电场对娃娃菜活性物质含量及抗氧化能力的影响

张映曈，张元元,2，赵欢欢,2，胡花丽，张雷刚，周宏胜，罗淑芬，李鹏霞,2,3,

（1.江苏省农业科学院农业设施与装备研究所，江苏 南京 210014；2.南京农业大学食品科学技术学院，江苏 南京 210095；3.江苏省高效园艺作物遗传改良重点实验室，江苏 南京 210014）

近年来，饮食引起的慢性疾病流行已成为一个重要的公共卫生问题。食用富含生物活性物质的食物，“使食物成为药物，使药物来源于食物”成为国内外食品和生命科学研究的热点[1]。娃娃菜（Brassica pekinensis）属十字花科芸薹属白菜亚种，因外形美观小巧、口感清脆、味道鲜美而备受消费者喜爱。更重要的是，娃娃菜中含有抗坏血酸、多酚、花色苷和硫代葡萄糖苷等活性成分[2]，具有清除自由基、抑制肿瘤细胞增殖、激活抗氧化酶体系等生物学功能[3]。流行病学研究指出食用以上活性成分可显著降低罹患心脑血管疾病、前列腺癌、结肠癌、肝癌和乳腺癌等疾病的风险[4]。

高强度脉冲电场（电场强度15～20 kV/cm）是一种在食品中应用的新型非热处理技术，可通过灭活微生物和酶使食品货架期延长4～6 周[5]。除了杀菌、灭酶，脉冲电场技术在其他方面的功能也逐渐被发现。例如，高压脉冲电场破坏细胞膜结构，增加细胞通透性，因而可用于特定成分的辅助提取[6]和加热干燥前处理[7]。而中强度脉冲电场（moderate intensity pulsed electric fields（MIPEF），电场强度低于5 kV/cm）则会诱导植物的代谢应激反应，从而刺激次级代谢产物的合成和积累[8]。MIPEF的这种作用被认为是通过生物电磁场改变细胞内部电荷的分布情况，并通过细胞内部电信号和能量的传递诱发具有防御作用的生物活性物质（如多酚和花色苷等）合成及其他代谢应激反应，以调节各种生理活性[9]。基于此，研究人员将MIPEF用于处理果蔬以获得高生物活性物质的轻度加工产品。

目前，在西红柿、土豆和鲜切苹果中关于MIPEF处理诱导生物活性物质代谢变化的研究较多[10-12]，对于其他种类的果蔬还缺乏足够系统的理论研究。因此，本实验以娃娃菜为研究对象，探讨不同MIPEF处理参数（电场强度和占空比）对其生物活性成分（酚类物质、抗坏血酸、谷胱甘肽、总硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯）含量以及抗氧化能力的影响，并对处理参数进行优化，以期得到活性物质含量较高的娃娃菜。研究成果将有助于加深对MIPEF预处理诱导果蔬代谢应激机制的理解，推动电磁微能技术的发展，同时为开发适用于未来果蔬采后产业的MIPEF设备和技术参数确定奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

高山娃娃菜产自甘肃兰州，2019年4月采购于南京众彩蔬菜批发市场，采购1 h内运送回实验室。

乙醇、甲醇、二氯甲烷、硼酸、氯化钯 国药集团化学试剂有限公司；福林酚、5-磺基水杨酸、谷胱甘肽还原酶、邻二氮菲、三氯乙酸 上海源叶生物技术有限公司；羧甲基纤维素钠、铁氰化钾、邻苯三酚 南京百斯凯科技有限公司；邻苯二硫醇 美国Sigma-Aldrich公司；氧化型谷胱甘肽 北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

DMC-200脉冲电场发生器（输出电压0～70 kV、占空比0.0%～49.2%） 大连鼎通科技发展有限公司；UV-1102紫外-可见分光光度计 上海天美科学仪器有限公司；Sigma3k15高速冷冻离心机 美国Sigma-Aldrich公司；IKAA11BS25液氮研磨器 艾卡（广州）仪器设备有限公司；PL202-L天平 瑞士Mettler Toledo公司；PHSJ-3F pH计 上海雷磁新径仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 脉冲电场处理

选择大小均匀、无明显机械损伤的娃娃菜进行脉冲电场处理。基于前期单因素试验结果[13]，采用中心复合响应面设计娃娃菜脉冲电场处理参数，因素水平见表1。处理时间为1 min，每个处理重复3 次。以未经脉冲电场处理的娃娃菜作为对照。处理完成的娃娃菜和对照组立即转移至4 ℃冰箱，放置24 h后，用液氮速冻并置于－20 ℃冰箱保存，待后续检测分析。

表1 响应面试验因素水平Table1 Factors and levels of response surface tests

1.3.2 指标测定

1.3.2.1 活性物质含量测定

总酚含量：参照Ghasemnezhad等[14]的方法略有改动。称取1.0 g样品，加入5 mL体积分数80%乙醇溶液充分研匀浆，4 ℃、12 000×g离心20 min，取0.1 mL上清液与0.5 mL福林酚试剂于25 ℃反应3 min，加入1.0 mL饱和碳酸钠溶液，25 ℃孵育1.0 h，测定760 nm波长处的溶液吸光度。总酚含量以每克样品中所含没食子酸当量表示，单位为μg/g。

花色苷含量：参照Mónica Giusti等[15]的方法略有改动。称取1.0 g样品，加入8 mL体积分数95%酸化甲醇避光提取4 h，4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清液1.0 mL，加入2.5 mL KCl-HCl缓冲液（pH 1.0）和醋酸钠缓冲液（pH 4.5），室温静置15 min，分别于520 nm和700 nm波长处测定溶液吸光度。花色苷含量以每克样品中含矢车菊素-3-O-葡萄糖苷当量表示，单位为mg/g。

抗坏血酸含量：采用2,6-二氯靛酚法[16]测定抗坏血酸含量，单位为mg/g。

谷胱甘肽含量：采用Ma Fengwang等[17]的方法略有改动。称取1.0 g样品，加入3 mL质量分数7%的5-磺基水杨酸溶液冰浴匀浆，4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清液0.2 mL，加入2 mL 0.2 mol/L磷酸缓冲液（pH 7.2）、0.2 mL 0.2 mol/L还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（reduced form of nicotinamide-adenine dinucleotide phosphate，NADPH）、1.0 mol/L 0.8 mL 5,5’-二硫双(2-硝基苯甲酸)、0.2 mL 1 U/mL谷胱甘肽还原酶（glutathione reductase，GR），27 ℃水浴40 min，于412 nm波长处测定吸光度。

总硫代葡萄糖苷含量：参照王淑雯[18]的方法略有改动。称取1.0 g样品，加入5 mL体积分数75%甲醇溶液80 ℃浸提15 min，10 000×g离心15 min，取上清液1.0 mL，加入1 mL 8.0 mmol/L氯化钯显色液和2 mL质量分数0.15%羧甲基纤维素钠溶液各1.0 mL，测定540 nm波长处吸光度。总硫代葡萄糖苷含量用每克样品中所含黑芥子苷当量表示，单位为μg/g。

异硫氰酸酯含量：称取1.0 g样品加入5 mL二氯甲烷振荡萃取，4 ℃、10 000×g离心15 min，取500 μL上清液，加入2 mL甲醇、1.8 mL 50 mmol/L硼酸缓冲液和0.2 mL 7 mmol/L邻苯二硫醇溶液，65 ℃下水浴1 h，于365 nm波长处测定吸光度。异硫氰酸酯含量以每克样品中所含萝卜硫素当量表示，单位μg/g。

1.3.2.2 抗氧化酶活力测定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力：参照赵世杰等[19]的方法测定，以抑制氮蓝四唑光化还原50%为一个酶活力单位，以U/g表示。

过氧化物酶（peroxidase，POD）活力：采用愈创木酚法测定[20]，以1 min内470 nm波长处吸光度减少0.01为一个酶活力单位，以U/g表示。

过氧化氢酶（catalase，CAT）活力：采用过氧化氢法测定[21]，以1 min内240 nm波长处吸光度减少0.1为一个酶活力单位，以U/g表示。

抗坏血酸过氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活力：参考Mohamed等[21]的方法略有改动。称取3.0 g样品加入10 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.5）匀浆，4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清液。反应体系为：0.2 mL上清液、1.5 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液、1 mL 2 mmol/L H2O2、0.6 mL 0.5 mmol/L还原型抗坏血酸。混合均匀后于290 nm波长处测定3 min内吸光度变化。以每克样品每分钟氧化1 μmol还原型抗坏血酸为一个酶活力单位，以U/g表示。

GR活力：参考Ma Fengwang等[17]的方法略有改动。称取3.0 g样品加入10 mL 50 mmol/L磷酸缓冲液（pH 7.5）匀浆，4 ℃、12 000×g离心20 min，取上清液。反应体系为：0.4 mL上清液、2.0 mL 50 mmol/L磷酸盐缓冲液（pH 7.0）、1.0 mL 1 mmol/L氧化型谷胱甘肽、1.0 mL 0.3 mmol/L NADPH。于340 nm波长处测定3 min内溶液吸光度变化。以每克样品每分钟催化1 nmol NADPH氧化为一个酶活力单位，以U/g表示。

1.3.3 抗氧化能力测定

称取样品1.0 g，加入5 mL体积分数95%乙醇溶液充分研磨，转移至10 mL刻度试管中，用体积分数95%乙醇溶液定容，浸提5 h，离心，收集上清液。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-dipenyl-2-pierylhydrazyl，DPPH）自由基清除率：参考Mohamed等[21]的方法略有改动。取上清液0.5 mL，加入3 mL DPPH-乙醇溶液，反应30 min，于517 nm波长处测定吸光度。

羟自由基清除率：参考Dong Tiantian等[22]的方法略有改动。取上清液0.1 mL，加入2 mL磷酸缓冲液、0.3 mL 5 mmol/L邻二氮菲溶液、0.2 mL 7.5 mmol/L FeSO4溶液，然后用1 mL体积分数0.02% H2O2溶液补足体积至8 mL。37 ℃保温1 h，于510 nm波长处测定溶液吸光度。

超氧阴离子自由基（O2－·）清除率：参考Alothman等[23]的方法略有改动。取上清液0.5 mL，加入2.5 mL Tris-HCl缓冲液和0.25 mL 0.1 mmol/L邻苯三酚溶液，充分混匀，25 ℃反应5 min后加入0.5 mL 0.8 mol/L HCl溶液终止反应，于425 nm波长处测定吸光度。

总还原力：参照Soong等[24]的方法略有改动。称取样品1.0 g，加入5 mL去离子水冰浴提取。取1.0 mL上清液与2.5 mL磷酸缓冲液（pH 6.6）和2.5 mL 1 g/100 mL铁氰化钾溶液避光条件下50 ℃反应20 min，加入2.5 mL10 g/100 mL三氯乙酸溶液振荡混匀。取混合溶液2.5 mL，加入2.5 mL去离子水、0.5 mL 0.1 g/100 mL氯化铁溶液，室温静置10 min，测定700 nm波长处吸光度。

以上结果均以每克样品的抗坏血酸当量表示，单位为mg/g。

1.4 数据处理与分析

所有实验均重复3 次，结果用平均值±标准差表示。用SPSS软件进行数据统计分析，采用方差分析（analysis of variance，ANOVA）进行差异显著性分析（P＜0.05）。用Design-Expert 12.0进行面中心复合响应面设计以及二次回归方程拟合和预测。用Graphpad Prism 8软件进行Pearson相关性分析并作图。

2 结果与分析

2.1 MIPEF对娃娃菜中生物活性物质含量的影响

2.1.1 总酚和花色苷含量

酚类物质是果蔬中重要的次级代谢产物，对果蔬的感官品质和营养价值有着重要影响。由表2可知，对照组娃娃菜总酚和花色苷含量分别为（236.25±14.05）μg/g和（44.91±3.82）mg/g，经MIPEF处理后，试验2、3、5～7与对照组相比，两种成分的含量均显著提高（P＜0.05）。其中总酚含量较对照组提高了2.76%～39.40%，花色苷含量较对照组提高了34.58%～85.13%。这与Galindo等[10]在马铃薯中的研究结果相似，在MIPEF处理24 h后，马铃薯组织代谢表现出以多酚含量提高为特征的应激反应。这可能与MIPEF刺激下苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）的活性增强有关[25]。植物中的多酚主要是在苯丙氨酸代谢过程中通过PAL作用产生。MIPEF被认为在细胞水平影响电压门控离子通道，使Ca2＋大量涌入阳离子通道，进而促进了Ca2＋依赖型蛋白激酶（Ca2＋-dependent protein kinase，CDPK）磷酸化PAL[26]。此外，CDPK还能促进活性氧的产生[27]，活性氧作为内源信号分子可促进酚类物质合成以防御外界胁迫。

通过中心复合响应面试验设计，本实验考察了MIPEF不同电场强度和占空比对娃娃菜中总酚和花色苷含量的影响。由表2和图1可知，随电场强度的提高，总酚和花色苷含量均呈先上升后下降的趋势；随占空比的增加，总酚和花色苷含量均呈上升趋势。对实验数据进行回归拟合，得到方程如下：Y1＝241.02＋93.46X1＋0.18X2＋0.35X1X2－46.34X12＋0.008X22（总酚含量）和Y2＝49.92＋49.25X1＋0.28X2＋0.034X1X2－22.28X12－0.036X22（花色苷含量）。通过ANOVA（表3）可知，两个回归方程模型的P值均小于0.01，说明模型极显著；失拟项P值均大于0.05，表明失拟不显著，决定系数R2分别为0.982 9和0.965 7，表明模型的预测结果与实际值拟合度高，因此该模型能够很好地预测和分析响应值。另外，电场强度（X1）对总酚含量影响显著（P＜0.05），占空比（X2）对总酚含量影响极显著（P＜0.01），对花色苷含量影响显著（P＜0.05）。因此，占空比对酚类物质含量的影响大于电场强度。

图1 电场强度和占空比对娃娃菜总酚（A）和花色苷（B）含量的影响Fig. 1 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the contents of total phenols (A) and anthocyanins (B) in baby cabbage

表2 中心复合响应面试验设计及结果Table2 Central composition design in terms of coded and experimental data with responses variables

表3 回归方程的方差分析Table3 Analysis of variance of regression models

2.1.2 抗坏血酸和谷胱甘肽含量

抗坏血酸和谷胱甘肽是重要的抗氧化成分，其含量是衡量娃娃菜营养价值的指标之一。由表2可知，试验2组与对照组相比，抗坏血酸含量显著提升（P＜0.05），为（38.16±1.19）mg/g，比对照组升高了16.06%；谷胱甘肽含量在所有处理条件下均显著提高（P＜0.05），是对照组的1.37～3.68 倍。这与Ade-Omowaye等[6]使用MIPEF处理红椒的研究结果略有不同，电场强度2 kV、脉冲次数50 次、处理400 ms后立即检测，结果发现MIPEF处理红椒中抗坏血酸含量没有显著提高，仅为对照组的89.6%～96.5%。这可能是因为植物识别外界刺激并启动相应防御系统积累刺激代谢产物需要一定的时间。Galindo等[10]的研究证实了这一观点，即MIPEF处理要在长时间作用后（以小时计量）才会影响组织代谢。本实验中娃娃菜经MIPEF处理后置于4 ℃贮藏24 h后谷胱甘肽和抗坏血酸含量的提升进一步证实了该观点。

根据中心复合响应面设计分析MIPEF电场强度和占空比对抗坏血酸和谷胱甘肽含量的影响，结果如表2和图2所示。随着电场强度增加，抗坏血酸和谷胱甘肽的含量先上升后下降；随占空比的增加，抗坏血酸含量先上升后下降，而谷胱甘肽含量呈缓慢上升趋势。对实验数据进行回归拟合，得到方程如下：Y3＝18.11＋23.58X1＋0.51X2－0.033X1X2－10.99X12－0.007 8X22（抗坏血酸含量）和Y4＝－2.30＋40.07X1－0.006 4X2＋0.11X1X2－16.45X12－0.004 2X22（谷胱甘肽含量）。采用ANOVA进行显著性检验及方差分析（表3）可知，回归方程模型的P值均小于0.05，说明模型显著；失拟项P值均大于0.05，表明失拟不显著，实验模型的决定系数R2分别为0.965 3和0.951 4，表明模型的预测结果与实际值拟合度高，因此该模型能够很好地预测和分析响应值。另外，电场强度（X1）对抗坏血酸含量影响显著（P＜0.05），占空比（X2）对抗坏血酸含量影响极显著（P＜0.01），说明占空比对抗坏血酸含量的影响大于电场强度；而对于谷胱甘肽含量，电场强度和占空比均影响显著（P＜0.05）。

图2 电场强度和占空比对娃娃菜抗坏血酸（A）和谷胱甘肽（B）含量的影响Fig. 2 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the contents of ascorbic acid (A) and glutathione (B) in baby cabbage

2.1.3 总硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯含量

硫代葡萄糖苷是十字花科植物中特有的抗氧化活性物质，在黑芥子酶作用下水解成异硫氰酸酯，是评价娃娃菜营养价值的重要指标[28]。由表2可知，经MIPEF处理后娃娃菜中总硫代葡萄糖苷含量与对照组相比提高了9.8%～63.6%（除试验6），异硫氰酸酯含量则在所有处理条件下均有提高，提高幅度为55.70%～818.03%。MIPEF的这种作用可能与其他非生物胁迫如褪黑素、ZnSO4等相似，通过调控硫代葡萄糖苷代谢途径相关基因的表达提高硫代葡萄糖苷以及下游异硫氰酸酯的含量[29]。

根据中心复合响应面设计分析MIPEF电场强度和占空比对总硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯含量的影响，结果如表3和图3所示。随着电场强度增加，总硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯的含量均先上升后下降；随占空比的增加，总硫代葡萄糖苷含量持续下降，异硫氰酸酯含量则呈上升趋势。对实验数据进行回归拟合，得到方程如下：Y5＝1.66＋1.91X1－0.000 22X2－0.001 8X1X2－0.82X12－0.000 17X22（总硫代葡萄糖苷含量）和Y6＝－2.86＋20.65X1＋0.085X2＋0.009 4X1X2－9.10X12＋0.000 32X22（异硫氰酸酯含量）。采用ANOVA进行显著性检验（表3）可知，回归方程模型的P值均小于0.05，说明模型显著；失拟项P值均大于0.05，表明失拟不显著，模型的决定系数R2分别为0.971 1和0.905 7，表明模型的预测结果与实际值拟合度高，因此该模型能够很好地预测和分析响应值。另外，占空比（X2）对总硫代葡萄糖苷含量影响极显著（P＜0.01），对异硫氰酸酯含量影响显著（P＜0.05），电场强度（X1）对两者影响均不显著（P＞0.05）。因此，占空比对总硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯含量的影响大于电场强度。

图3 电场强度和占空比对娃娃菜总硫代葡萄糖苷（A）和异硫氰酸酯（B）含量的影响Fig. 3 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the contents of total glucosinolate (A) and isothiocyanate (B) in baby cabbage

2.2 MIPEF对抗氧化酶活性的影响

2.2.1 SOD、POD和CAT活力

SOD、POD和CAT是植物中重要的抗氧化酶系，在抵御外界不良环境和衰老过程中发挥重要作用。由表2可知，除试验4外，SOD活力与对照组相比均有提高（2.22%～6.67%）；POD活力在试验2、3、6和9条件下活力显著提高（P＜0.05），为对照组的1.07～1.38 倍；CAT活力较对照组则提高了5.28%～14.25%（除试验1、4、6和8）。根据中心复合响应面设计研究电场强度和占空比对SOD、POD和CAT活力的影响，结果如表3和图4所示。随着电场强度增加，SOD、POD和CAT的活力均呈现先上升后下降的趋势；而随占空比的增加，3 种酶活力均呈持续上升趋势。对实验数据进行回归拟合，得到方程如下：Y7＝0.45＋0.037X1＋0.000 41X2＋0.000 15X1X2－0.021X12－6.68X22（SOD活力）、Y8＝25.79＋100.87X1－0.15X2＋0.24X1X2－40.83X12＋0.005 3X22（POD活力）和Y9＝52.91＋32.21X1＋0.31X2－0.099X1X2－13.93X12－0.000 52X22（CAT活力）。采用ANOVA进行显著性检验及方差分析（表3）可知，回归方程模型的P值均小于0.05，说明模型显著；失拟项P值均大于0.05，表明失拟不显著，实验模型的决定系数R2分别为0.900 7、0.968 6和0.941 5，表明模型的预测结果与实际值拟合度高，因此该模型能够很好地预测和分析响应值。另外，电场强度（X1）和占空比（X2）对SOD活力均影响显著（P＜0.05），且电场强度影响更大；电场强度（X1）对POD活力影响显著（P＜0.05），占空比（X2）影响极显著（P＜0.01）；电场强度（X1）和占空比（X2）对CAT活力影响显著（P＜0.05），且占空比影响更大。

图4 电场强度和占空比对娃娃菜SOD（A）、POD（B）和CAT（C）活力的影响Fig. 4 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the activities of SOD (A), POD (B)and CAT (C) in baby cabbage

2.2.2 GR和APX活力

抗坏血酸-谷胱甘肽循环是植物体内有效的活性氧清除系统，对园艺作物延缓衰老、延长货架期具有重要作用，GR和APX是该循环中两种重要的酶，负责维持氧化还原平衡[30]。由表2可知，与对照组相比，GR活力在所有MIPEF处理条件下显著增加（P＜0.05），提高幅度为6.22%～42.00%；除了试验4条件下，其他处理均使APX活力显著提高（P＜0.05），提高幅度为2.00%～9.58%。根据中心复合响应面设计研究电场强度和占空比对GR和APX活性的影响，结果如表3和图5所示。随着电场强度的增加，GR和APX活力均先上升后下降；随占空比增加，GR活力呈下降趋势，APX活力呈上升趋势。对实验数据进行回归拟合，得到方程如下：Y11＝172.93＋65.98X1－0.26X2－0.30X1X2－24.50X12＋0.002 4X22（GR活力）和Y10＝782.04＋83.66X1＋2.41X2＋0.057X1X2－47.58X12－0.003 3X22（APX活力）。采用ANOVA进行显著性检验及方差分析（表3）可知，回归方程模型的P值均小于0.05，说明模型显著；失拟项P值均大于0.05，表明失拟不显著，实验模型的决定系数R2分别为0.911 1和0.970 0，表明模型的预测结果与实际值拟合度高，因此该模型能够很好地预测和分析响应值。另外，电场强度（X1）和占空比（X2）对GR活力均影响显著（P＜0.05），其中占空比影响更大；电场强度（X1）和占空比（X2）对APX活力均影响极显著（P＜0.01），其中电场强度影响更大。

图5 电场强度和占空比对娃娃菜GR（A）和APX（B）活力的影响Fig. 5 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on the activities of GR (A) and APX (B) in baby cabbage

2.3 MIPEF对抗氧化能力的影响

2.3.2 总还原力

总还原力也是衡量植物组织抗氧化能力的重要指标。由表2可知，除了试验1、4、8，其他条件下MIPEF处理均使总还原力显著提升（P＜0.05），提高幅度为1.81%～12.66%。根据中心复合响应面设计研究电场强度和占空比对总还原力的影响，结果如表3和图6D所示。总还原力随电场强度的增加先上升后下降，随占空比的增加则呈现上升趋势。对实验数据进行回归拟合，得到方程如下：Y15＝5.44＋2.45X1－0.001 6X2＋0.010X1X2－1.31X12＋0.000 29X22。采用ANOVA进行显著性检验及方差分析（表3）可知，回归方程模型的P值小于0.05，说明模型显著；失拟项P值大于0.05，表明失拟不显著，实验模型的决定系数R2为0.917 4，表明模型的预测结果与实际值拟合度较高，因此该模型能够较好地预测和分析响应值。另外，电场强度（X1）对总还原力影响显著（P＜0.05）。

图6 电场强度和占空比对娃娃菜DPPH自由基（A）、·OH（B）和O2－·（C）清除率以及总还原力（D）的影响Fig. 6 Response surface plots showing the effects of electrical field intensity and duty ratio on scavenging activity toward DPPH (A), ·OH (B)and O2-· (C) radicals, and total reducing power (D) in baby cabbage

2.4 MIPEF处理条件的优化与验证

使用Design Expert软件进行条件优化，设置各响应值目标和等级，得到最佳MIPEF处理条件为电场强度1.14 kV/cm、占空比46.40%，此时预测的各响应值为总酚含量331.14 μg/g、花色苷含量84.08 μg/g、抗坏血酸含量35.78 mg/g、谷胱甘肽含量26.60 μg/g、总硫代葡萄糖苷含量2.28 μg/g、异硫氰酸酯含量14.00 μg/g、SOD活力0.48 U/g、POD活力104.94 U/g、CAT活力79.80 U/g、GR活力188.92 U/g、APX活力859.39 U/g、DPPH自由基清除率0.23 mg/g、·OH清除率1.04 mg/g、O－2·清除率1.69 mg/g、总还原力6.96 mg/g。为检验模型准确性和考虑实际情况，将最优工艺修改为电场强度1.1 kV/cm、占空比46.4%，在此条件下平行实验3 次，得出各指标为总酚含量321.25 μg/g、花色苷含量80.35 mg/g、抗坏血酸含量35.16 mg/g、谷胱甘肽含量23.65 μg/g、总硫代葡萄糖苷含量2.05 μg/g、异硫氰酸酯含量13.00 μg/g、SOD活力0.43 U/g、POD活力99.56 U/g、CAT活力71.35 U/g、GR活力195.34 U/g、APX活力834.32 U/g、DPPH自由基清除率0.23 mg/g、·OH清除率0.90 mg/g、O－2·清除率1.52 mg/g、总还原力6.65 mg/g。由此可见，验证实验值与模型预测值比较接近，达到预测值的88.91%～103.40%，表明预测结果较优。

2.5 MIPEF处理的娃娃菜中活性物质含量、抗氧化酶活力和抗氧化能力的相关性

将MIPEF处理的娃娃菜中活性物质含量、抗氧化酶活力和抗氧化能力进行Pearson相关性分析发现，总酚含量与O－2·清除率和总还原力显著相关（P＜0.05）；花色苷含量与·OH清除率和O－2·清除率显著相关（P＜0.05）；抗坏血酸含量与DPPH自由基清除率以及总还原力极显著相关（P＜0.01），与O－2·清除率显著相关（P＜0.05）；异硫氰酸酯含量与DPPH自由基、·OH清除率和O－2·清除率均具有显著相关性（P＜0.05、P＜0.01），与总还原力也显著相关（P＜0.05）（图7）。以上结果表明这些活性物质的含量是影响娃娃菜抗氧化能力、贮藏品质的重要因素。它们将与娃娃菜贮藏过程中产生的自由基直接反应对其清除，有效减少细胞损伤进而延缓衰老进程。然而高强度的PEF处理会促进大孔隙的形成，将可逆渗透转变为不可逆击穿，加速植物组织的衰老[31]。在本实验中，电场强度从0.4 kV/cm提高至1.2 kV/cm时，所有活性物质含量和抗氧化能力均显著上升，但继续提高至2.0 kV/cm后，活性物质含量及抗氧化能力反而降低。这可能是因为2 kV/cm超过了娃娃菜细胞膜能承受的临界强度，破坏了细胞结构稳定性甚至造成机械损伤，自由基产生的速率超过氧化防御系统清除自由基的速率，使得总体表现为负效应[32]。除了MIPEF诱导的应激反应，也有研究认为生物活性物质含量的提高与MIPEF处理增加了细胞膜的渗透性有关。例如，Luengo等[33]用MIPEF处理（5 kV/cm、90 μs）番茄副产物后类胡萝卜素含量与对照组相比提高了39%。但Soliva-Fortuny等[5]研究认为这种次级代谢产物含量的提高更多地归因于MIPEF的胁迫诱导，而非细胞膜透性增加导致的提取率提高。因为当施加电场强度为0.5 kV/cm时，葡萄中总酚提取率为24%，远高于电场强度为2.4 kV/cm时的提取率（14%）[34]。这也与本实验中电场强度提高至2 kV/cm后生物活性物质含量反而降低一致。

图7 MIPEF处理的娃娃菜中活性物质含量、抗氧化酶活力和抗氧化能力的Pearson相关性Fig. 7 Correlation analysis among the contents of bioactive compounds, the activities of antioxidant enzymes and antioxidant capacity in baby cabbage treated with MIPEF

3 讨 论

自由基是果蔬在代谢过程中产生的一种化学性质活泼的代谢产物，主要分为活性氧和活性氮两类，构成了果蔬的防御系统。在采后贮藏过程中，自由基堆积过量进而引起氧化应激，造成植物组织在分子水平和细胞水平上的各种损伤，加速衰老进程。在长期进化过程中，果蔬形成了一套清除自由基的自我保护系统，由非酶类清除剂和酶类清除剂组成：非酶类清除剂一般包括黄酮类、多糖类、类胡萝卜素、抗坏血酸和还原型谷胱甘肽等活性物质；酶类清除剂则主要是抗氧化酶，如SOD、CAT、APX等。

在酶类清除剂方面，MIPEF首先促使果蔬抗氧化系统的第一道防线SOD活力显著提高（与对照组相比提高了2.22%～6.67%），可加速将O－2·歧化为H2O2和O2，同时阻止Fe3＋重新受超氧阴离子还原生成Fe2＋进而催化形成毒性更强的·OH。另外，POD和CAT在经MIPEF处理后活力也显著提高（5.28%～38.45%），可将上一步反应的产物H2O2加速转化为无毒性的H2O和O2，未反应的H2O2则进入谷胱甘肽-抗坏血酸循环。MIPEF处理促使APX和GR活力分别上升2.00%～9.58%和6.22%～42.00%，促进抗坏血酸和还原型谷胱甘肽的积累（图8）。作为谷胱甘肽-抗坏血酸循环的重要底物，谷胱甘肽和抗坏血酸含量的增加可促进酶催化降解H2O2的速率产生无毒性的H2O和O2。MIPEF对酶活力的这种影响主要涉及焦耳热损耗和电荷转移引起的蛋白构象变化[35]，并随着酶分子结构、食物基质、温度、处理装置和设备参数等因素的不同，产生的影响也不同[8]。例如，Barbosa-Canovas等[36]发现液态蛋蛋白性质不受脉冲电场影响，于电场强度26 kV/cm、方波脉冲数100下暴露2～4 μs，未见蛋白质凝固；在48 kV/cm电场中，每单位体积10 个指数衰减脉冲的情况下，液态蛋的蛋白电泳模式未发生改变。而在其他研究中发现，MIPEF处理可通过改变蛋白的二级结构使某些酶降低或失去活性，例如多酚氧化酶[37]、果胶甲基酯酶[38]、木瓜蛋白酶[39]、血纤维蛋白溶酶[40]、脂肪酶[41]和蛋白酶[42]等。然而在某些情况下，MIPEF会促进酶活力的提高。例如，陈敏[32]用MIPEF处理樱桃番茄后，SOD和POD活力显著上升，24～48 h后呈下降趋势，但仍然高于对照组和不可逆电场组。许强等[43]的研究表明，1.0～6 kV/cm范围的电场作用能使蛋白二级结构产生由β-折叠、β-转角向α-螺旋及无规卷曲转化的趋势。在此情况下，可能使SOD和POD的活性中心暴露，提高与底物作用的几率[32]，这可能也是本实验中抗氧化酶系活性提高的内在机制。将抗氧化酶活力与抗氧化能力指标进行相关性分析发现，SOD和CAT活力与所有抗氧化能力指标显著相关（P＜0.05、P＜0.01）；POD活力与DPPH自由基、·OH清除率和O－2·清除率显著相关（P＜0.05、P＜0.01）；APX活力与DPPH自由基、O－2·清除率和总还原力呈显著相关（P＜0.05、P＜0.01）（图7），表明抗氧化酶系活性提高是娃娃菜自由基清除能力提升，维持其贮藏品质的重要因素。

图8 MIPEF处理清除娃娃菜自由基的机制Fig. 8 Mechanism by which MIPEF scavenges free radicals in baby cabbage

综上，MIPEF处理引起的非酶类清除剂（生物活性物质）和酶类清除剂（抗氧化酶）活性的提高是清除娃娃菜自由基的潜在机制 。

4 结 论

MIPEF处理1 min后贮藏24 h，诱导娃娃菜产生应激代谢响应：一方面，刺激了总酚、花色苷、抗坏血酸、谷胱甘肽、总硫代葡萄糖苷和异硫氰酸酯等生物活性物质的合成；另一方面，促进了POD、SOD、CAT、APX等抗氧化酶系活力的提高。这两方面作用促使娃娃菜的自由基清除能力提升，有效延缓了娃娃菜的衰老进程，并增强了其营养品质。当电场强度为1.1 kV/cm、占空比为46.4%时，MIPEF处理后娃娃菜营养品质和抗氧化性能综合评分最高。以上结果表明脉冲电场是一种极具潜力的果蔬非热预处理方式，结合其在杀菌灭酶方面的表现，在果蔬提质保鲜方面具有广阔的应用前景。