区域性耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌耐药基因型的分析*

佟忠山，尤玉红，姜月红，杜 英，杜 巍，孙 磊

黑龙江省医院检验科，黑龙江 哈尔滨 150001

肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，KPN）是临床感染性疾病常见的病原菌，可引起社区获得性感染和医院感染，约占临床革兰阴性细菌感染的30%，可引起呼吸道、血液、腹腔和泌尿系统等部位感染，特别是免疫力低下的人群更易感染［1］。碳青霉烯类抗菌药物是抗菌谱最广，抗菌活性最强的非典型β-内酰胺类抗生素，已成为治疗严重细菌感染的最主要抗菌药物之一，随着碳青霉烯类抗菌药物在临床的广泛应用，全国耐药监测网统计显示耐碳青霉烯类抗生素肺炎克雷伯菌（carbapenem resistant Klebsiella pneumoniae，CR-KPN）检出率持续上升，从2013年的4.9%上升至2019年的10.9%［2］，为临床抗感染的治疗增加很多困难和经济成本，区域CR-KPN耐药性及耐药基因的研究，为本地区CR-KPN院感防控及临床相关感染治疗提供依据。

1 材料与方法

1.1 菌种来源

黑龙江省医院是哈尔滨地区三甲医院，收集医院2018年1月—2020年12月临床分离的KPN 3 371株，去除同一患者同一部位相同菌株，以首次分离菌为准。筛选亚胺培南、美罗培南和厄他培南任一非敏感菌株为CR-KPN的36株纳入本研究。

1.2 仪器与试剂

BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定、药敏系统及其配套试剂（美国碧迪公司）。美罗培南药敏纸片（英国Oxoid公司），替加环素药敏纸片（美国辉瑞公司），血平板、麦康凯平板和MHA平板（郑州博赛公司）。碳青霉烯酶检测试剂盒购于长沙中生众捷生物技术有限公司。

1.3 标准质控菌株

大肠埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603，购自国家卫生健康委临床检验中心。

1.4 菌株鉴定及药敏试验

菌株分纯配制0.5麦氏浊度菌悬液，经BD PhoenixTM-100全自动细菌鉴定/药敏系统进行细菌鉴定及药敏试验，并用Kirby-Bauer法补充替加环素和头孢哌酮/舒巴坦药敏试验，结果按美国临床微生物实验室CLSI M100第30版标准判读。

1.5 碳青霉烯酶表型筛查

筛查参考美国临床微生物实验室CLSI M100第30版改良碳青霉烯灭活试验方法，取血平板上过夜孵育的1 ul满环KPN接种至2 ml TSB中，漩涡震荡10～15 s，用无菌镊子将一张10μg美罗培南纸片加入每一菌液管中，确保纸片完全浸没于菌悬液中。在35±2℃空气环境孵育4 h±15 min，完成TSB-美罗培南纸片菌悬液孵育后，立即用生理盐水或营养肉汤制备大肠埃希菌ATCC25922 0.5麦氏浊度标准菌悬液，按纸片扩散法常规步骤将大肠埃希菌ATCC25922涂布于MHA培养基上，平板干燥3～10 min后，使用10μl接种环从TSB-美罗培南纸片菌悬液中取出，贴在事先涂有大肠埃希菌ATCC25922的MHA琼脂表面。在空气环境35±2℃孵育18～24 h后，测量抑菌圈直径6～15 mm之间或16～18 mm抑菌圈内存在针尖样菌落为碳青霉烯酶阳性。

1.6 耐药基因检测

取提取缓冲液5滴加入EP管中，使用1 ul接种环取一环碳青霉烯酶表型筛查阳性待测菌株置于含有提取缓冲液的EP管中，合上EP管，使用涡旋仪震荡混匀后放置室温10 min，然后用吸管吸取5滴制备好的混合液，加入胶体金免疫层析检测卡中，室温放置15 min读取结果。C线区出现一条红线并且在K、O、V、I、N检测线区出现一条或多条红线判读为阳性结果，同时对blaKPC、blaOXA-48、blaVIM、blaIMP和blaNDM五种常见碳青霉烯酶基因型进行检测［3］。

2 结果

2.1 CR-KPN临床分布情况

2018年1月—2020年12月医院分离出3 371株KPN，其中36株CR-KPN（1.07%），主要分离自神经外科（25%），ICU、康复科、呼吸科和心血管内科（各13.9%）；CR-KPN感染患者年龄主要集中在80岁以上老年群体（36.1%），并且以男性患者为主（83.3%），多分离自呼吸道标本（66.1%），见表1。

表1 36株CR-KPN的临床分布情况

2.2 药敏结果

36株CR-KPN对临床常见抗菌药物药敏结果如表2所示，对氨苄西林/舒巴坦、哌拉西林、头孢噻肟、头孢唑啉、亚胺培南的耐药率为100%，对氨曲南、头孢吡肟、阿莫西林/克拉维酸、环丙沙星、四环素、头孢他啶、哌拉西林/他唑巴坦、头孢哌酮/舒巴坦、美罗培南的耐药率接近100%，但阿米卡星（5.56%）、替加环素（35.49%）和庆大霉素（44.44%）的耐药率低于45%，氯霉素和左氧氟沙星也有20%以上的敏感度，见表2。

表2 36株CR-KPN对临床常见抗菌药物耐药性统计表

2.3 碳青霉烯酶表型试验及基因检测结果

36株CR-KPN改良碳青霉烯灭活试验阳性率100%，耐药基因检出情况如表3所示。医院分离的CR-KPN主要携带blaKPC基因型，检出blaKPC35株（97.22%），检出blaNDM，联产blaKPC+blaVIM和blaKPC++blaIMP各1株（2.78%），未检出blaOXA-48，见表3。

表3 36株耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌（CRKP）耐药基因检出情况

3 讨论

全国CR-KPN检出率从2014年的6.4%上升至2019年10.9%。通过医院研究结果表明本地区明显低于全国CR-KPN检出率，但近两年呈逐年上升趋势，需引起临床高度重视。CR-KPN主要来源于神经外科、ICU和康复、呼吸等科，患者合并两种以上慢性病，住院时间超过三周，留置插管两种以上，应用碳青霉烯类药物一周以上易检出CR-KPN感染［4］，存在上述危险因素患者需加强病原菌监测，尽早检出并及时治疗。

本研究结果显示，医院检出的CR-KPN对一二三四代头孢菌素及克拉维酸和舒巴坦等常用酶抑制剂β-内酰胺类抗生素都耐药，对阿米卡星和庆大霉素氨基糖苷类、四环素类等抗生素有一定敏感度，可能与氨基糖苷类抗生素主要通过与细菌核糖体结合，干扰细菌蛋白质的合成，发挥杀菌作用，与碳青霉烯类抗生素作用机制不同有关，上述情况与李珂等的研究结果一致［5］。CR-KPN耐药广，而且氨基糖苷类和四环素类抗生素副作用大，限制了临床使用，新药头孢他啶/阿维巴坦对blaKPC基因型CR-KPN有很好抑制作用，对blaNDM基因型CR-KPN无作用，而携带blaNDM金属酶的CR-KPN对氨曲南水解作用弱，氨曲南对其有一定抑制作用，所以可以参考耐药基因型合理选择抗菌药物治疗。

综上所述，哈尔滨地区CR-KPN临床检出逐年增加，其耐药性强，难清除，临床抗感染难道大，需加强病原菌监测，并进行耐药基因检测，CR-KPN耐药机制复杂，需进一步研究更好指导临床合理使用抗菌药物，做好院感防控避免院内感染的爆发流行。