长链非编码RNA PCGEM1及信号传导转录激活因子3在卵巢癌中的表达及意义

杨长香，韩自旺，史天云

卵巢癌是女性生殖器官常见恶性肿瘤之一，好发于绝经期女性，发病率仅次于宫颈癌和子宫体癌，且近年来呈逐渐上升趋势，死亡率居妇科恶性肿瘤首位。卵巢癌发病早期无特异性症状，70%病人确诊时已为中晚期，导致治疗效果及预后差，至今5 年生存率不超过30%，严重威胁女性生命健康。因此，寻找特异性反应卵巢癌早期病理特征的肿瘤标志物成为近来临床研究热点。长链非编码RNA（lncRNA）是一类在多物种中具有高度保守性的非编码RNA，研究发现，lncRNA 在卵巢癌的发生发展中发挥主要作用。有研究报道，lncRNA PCGEM1 可通过RA 通路诱导卵巢癌发生发展。信号传导转录激活因子3（signal transducer and acti‑vator of transcription proteins3，STAT3）具有信号转导和转录调控双重功能，研究显示，STAT3异常表达与卵巢癌、乳腺癌等密切相关。有研究发现，ln‑cRNA PCGEM1 可通过上调STAT3 表达参与子宫内膜癌的发病及病情进展。然而关于LncRNA PC‑GEM1 和STAT3 在卵巢癌中的关系及作用鲜有研究。因此本研究拟观察卵巢癌及正常卵巢组织中LncRNA PCGEM1 和STAT3 表达水平，并分析二者与病人预后的关系，旨在为预后评估提供辅助依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2013 年3 月至2014 年12 月在南阳市第一人民医院行卵巢摘除手术的卵巢癌病人108例，均经术后病理确诊，年龄（55.14±8.53）岁，范围为35～70 岁。根据2000 年国际妇产科联盟临床分期（FIGO）分为：Ⅰ+Ⅱ期59 例，Ⅲ+Ⅳ期49例；病理分级：G1+G2级62例，G3级46例；淋巴结转移49 例，无淋巴结转移59 例；铂类耐药41 例，铂类敏感67 例。另因卵巢囊肿需作手术切除但已证实无肿瘤细胞的正常卵巢组织108 例，年龄（53.69±9.18）岁，范围为35～69 岁。两组年龄比较，差异无统计学意义（

t

=1.202，

P

=0.230），具有可比性。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 纳入、排除标准

纳入标准：（1）经病理确诊为卵巢癌或良好性卵巢囊肿病人；（2）均行卵巢摘除术；（3）成年女性；（4）半年内未接受放化疗或其他抗肿瘤药物治疗；（5）病人及其近亲属均知情同意。

排除标准：（1）有其他妇科疾病或恶性肿瘤者；（2）心、肝等功能异常者；（3）月经期妇女；（4）资料缺失。

1.3 方法

1.3.1 标本采集

术中收集的卵巢癌及正常卵巢组织标本，分两份，一份离体后置于液氮中保存，用于检测lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表达水平；另一份制成石蜡标本，用于检测STAT3蛋白表达。

1.3.2 检测lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表达水平

采用实时荧光定量PCR（real-time quantitative PCR，RT-qPCR）检测卵巢癌及正常卵巢组织中ln‑cRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 相对表达量，仪器购自美国Bio-Rad 公司。采用RNA 提取试剂盒（编号R0011，上海碧云天有限公司）提取组织总RNA，其浓度及纯度合格后反转录得到cDNA，检测浓度及纯度的仪器为紫外分光光度计，置于-20 ℃保存备用。qRT-PCR 反应采用20 μL 体系：TB Green Pre‑mix Ex Taq Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（2× ）（ 编 号RR820A，TaKaRa 生物公司）10 μL，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ（50×）0.4 μL ，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（由上海生工合成）（10 μmol/L）各0.8 μL，ddHO 6.0 μL。 反应 条件为：95 ℃30 s；95 ℃5 s；60 ℃34 s，40 个循环。lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 及内参β-actin 的引物序列见表1。利用公式2计算lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA相对表达量。

表1 RT-qPCR引物序列

1.3.3 检测STAT3 蛋白表达水平

石蜡组织连续切片，厚约4 μm，接下来进行烘烤、脱水、苏木素复染等处理。由2名经验丰富医师共同对染色结果进行半定量评分，方法为双盲法。STAT3 蛋白阳性主要表达在细胞质或核内，主要呈黄色或棕色颗粒。采用免疫反应积分（IRS）法评估染色情况：（1）染色强度（SI）积分，无着色、淡黄色、棕黄色、棕褐色分别为0、1、2、3 分；（2）阳性染色细胞百分比（PP）积分，阴性为0 分，PP 1%～10% 为1 分，PP 11%～50% 为2分，PP 51%～75% 为3 分，PP 76%～100% 为4 分。IRS = SI×PP，IRS>3为阳性。

1.4 随访

对出院后的卵巢癌病人进行为期1～60个月的随访，随访方式为打电话或门诊复查，随访频率为每月1 次，以病人死亡或随访至2019 年3 月31 日终止，记录病人随访期间生存情况，便于进行统计分析。

2 结果

2.1 卵巢癌及正常卵巢组织中lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表达水平比较

卵巢癌组织中ln‑cRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表达水平均明显高于正常卵巢组织（

P

<0.05）。见表2。

表2 卵巢癌及正常卵巢组织中长链非编码RNA PCGEM1（lncRNA PCGEM1）与信号传导转录激活因子3（STAT3）mRNA表达水平比较/± s

2.2 STAT3 蛋白在卵巢癌及正常卵巢组织中阳性表达水平比较

STAT3 蛋白在细胞核及细胞质中均有表达，呈棕黄色颗粒。与正常卵巢组织比较，卵巢癌组织中STAT3 蛋白阳性表达率显著升高，均差异有统计学意义（

P

<0.05）。见表3，图1。

表3 正常卵巢及卵巢癌组织中信号传导转录激活因子3（STAT3）蛋白阳性表达率比较/例（%）

2.3 lncRNA PCGEM1 及STAT3 蛋白表达水平与卵巢癌临床病理参数的关系

STAT3蛋白阳性表达组76 例和阴性表达组32 例，以lncRNA PCGEM1 表达水平平均数（2.41）为界，分为lncRNA PCGEM1 高表达组（≥2.41）62 例和低表达组（<2.41）46 例。ln‑cRNA PCGEM1 及STAT3 蛋白表达水平与卵巢癌病人的年龄无关（

P

>0.05），与FIGO分期、病理分级、是否铂类耐药、有无淋巴结转移有关（

P

<0.05）。见表4。

表4 长链非编码RNA PCGEM1（lncRNA PCGEM1）及信号传导转录激活因子3（STAT3）蛋白表达水平与卵巢癌临床病理参数的关系/例（%）

2.4 lncRNA PCGEM1及STAT3 mRNA 水平相关性分析

Pearson 法分析结果显示，卵巢癌组织中lncRNA PCGEM1 及STAT3 mRNA 水平呈正相关（

r

=0.575，

P

<0.05）。见图2。

图2 卵巢癌组织中lncRNA PCGEM1及STAT3 mRNA水平相关性分析

2.5 生存曲线分析

随访5 年，108 例卵巢癌病人总生存率为29.63%（32/108）。lncRNA PCGEM1 高表达组5 年生存率为8.33%，显著低于低表达组54.35%（χ=39.51，

P

<0.001），STAT3 蛋白阳性表达组5 年生存率为13.16%，显著低于阴性表达组68.75%（χ=26.16，

P

<0.001）。

2.6 COX 分析影响卵巢癌病人预后的危险因素

COX 多因素分析显示，顺铂耐药、淋巴结转移、ln‑cRNA PCGEM1高表达、STAT3蛋白阳性表达是影响卵巢癌病人预后的独立危险因素（

HR

=3.569，95%

CI

为2.114～6.025；

HR

=3.563，95%

CI

为1.827～6.949；

HR

=2.786，95%

CI

为1.495～5.192；

HR

=1.897，95%

CI

为1.161～3.096，均

P

<0.05），见表5。

表5 影响卵巢癌病人预后的危险因素分析结果

3 讨论

LncRNA 参与多种生物过程，具有调控细胞增殖、分化等过程的作用，与多种恶性肿瘤的发生密切相关。随着芯片技术和高通量测序方法的进步，越来越多LncRNA 被发现，约1 749 种与卵巢癌有关。Chen 等研究发现，上皮性卵巢癌组织中LncRNA PCGEM1 表达水平较正常卵巢上皮组织高。Li 等研究证实，与正常子宫内膜组织比较，LncRNA PCGEM1 在子宫内膜癌组织中表达上调，且lncRNA PCGEM1 可上调STAT3 的表达，影响子宫内膜癌的发生和发展。而STAT3 是一类以二聚体形式进入细胞核与靶DNA 序列结合、相对分子质量为92 kDa 的转录因子，主要存在于细胞质，可被多种细胞因子或其他胞外信号激活发挥生物学作用。正常生理状态下，STAT3 蛋白的激活短暂而迅速，而STAT3 过度表达、持续激活与卵巢癌等多种恶性肿瘤血管生成、细胞增殖凋亡有关。王庆涛等研究发现，乳腺癌组织中STAT3 阳性表达率显著高于癌旁组织。雷波等研究发现，Th22 细胞通过释放IL-22 活化STAT3 通路，使卵巢癌组织中STAT3 磷酸化蛋白表达水平显著高于癌旁组织，以促进卵巢癌的发展。本研究结果发现，卵巢癌组织中lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 表 达 水 平 及STAT3 蛋白阳性表达率显著高于正常卵巢组织，且二者呈正相关，提示lncRNA PCGEM1 高表达、STAT3 蛋白阳性表达可能共同作用，与卵巢癌发生有关。

Chen 等研究发现，lncRNA PCGEM1 表达水平与卵巢癌病理分级有关。王庆涛等研究发现，STAT3 蛋白阳性表达与乳腺癌FIGO 分期、TNM 分期有关。本研究结果发现，卵巢癌组织中lncRNA PCGEM1 高表达、STAT3 蛋白阳性表达与病人FIGO分期、病理分级、铂类耐药及淋巴结转移有关，提示lncRNA PCGEM1 高表达、STAT3 蛋白阳性表达可能与卵巢癌的病情进展有关。李硕果等研究显示，STAT3在食管癌中高表达且可能与食管癌病人预后差有关。王庆涛等发现，STAT3 高表达乳腺癌病人生存期短，预后差。本研究生存分析发现，ln‑cRNA PCGEM1 高表达、STAT3 蛋白阳性表达病人5年生存率显著低于lncRNA PCGEM1 低表达、STAT3蛋白阴性表达病人，提示lncRNA PCGEM1 高表达、STAT3 蛋白阳性表达可能影响卵巢癌病人生存期。进一步COX 多因素分析结果显示，除顺铂耐药和淋巴结转移因素外，lncRNA PCGEM1 高表达、STAT3蛋白阳性表达是影响卵巢癌病人预后的独立危险因素，再次表明lncRNA PCGEM1 高表达、STAT3 蛋白阳性表达与卵巢癌病人预后差密切相关，有潜力成为监测卵巢癌病情进展及预后评估的标志分子。

综上所述，卵巢癌组织中lncRNA PCGEM1、STAT3 mRNA 及蛋白高表达，二者高表达与病人FI‑GO 分期、病理分级等临床病理参数及5年生存情况有关，检测二者表达有利于早期评估病人预后。但关于lncRNA PCGEM1、STAT3 与卵巢癌发生发展的具体作用机制及二者具体调控关系尚有待进一步加大样本量、深入研究。