重组人干扰素γ对变应性鼻炎大鼠Toll样受体4/核因子-B信号通路及血清炎症因子的影响

陆智芸，许水森，农应全

变应性鼻炎（AR）是变应原吸入机体后造成T淋巴细胞等炎症细胞浸润，免疫球蛋白E（IgE）所介导免疫细胞将化学递质释放后引发的变态反应炎性疾病，临床表现喷嚏、鼻黏膜肿胀及鼻痒等。相关流行病学研究显示，国内AR发病率逐年升高，已是临床主要呼吸道疾病之一。当前，临床对AR 治疗主要为白三烯受体拮抗剂、抗组胺类及糖皮质激素等药物，关于重组人干扰素γ（IFN-γ）对AR治疗机制研究较少。在AR致敏与激发阶段中IgE有重要影响，有报道称，AR 疾病严重程度和IgE 含量呈正相关。IFN-γ 作为巨噬细胞活化因子，由活化Th1细胞所分泌，可对IgE所介导变态反应拮抗，有免疫调节作用。Toll样受体（TLRs）为主要免疫受体，对不同病原体识别并启动不同信号传导通路，在机体获得性与先天性免疫中有重要影响。NF-B在几乎所有细胞内均存在，对细胞生长发育及机体的免疫应答、炎症反应可起到重要作用，在变应性疾病中，核因子- B（NF-B）参与嗜酸性粒细胞的浸润、迁移和生长等，并使相关细胞因子激活，对嗜酸性粒细胞凋亡抑制；还可加速白细胞介素-5（IL-5）、IL-4等Th2相关细胞因子表达，抑制IFN-γ等Th1相关细胞表达，对Th1/Th2平衡影响。因此，本研究自2019年5―11月分析重组人干扰素γ对AR大鼠TLR4/NF-B信号通路及炎症因子影响，报告如下。

1 材料与方法

1.1 实验大鼠

SPF级雄性大鼠60只，6周龄，购自成都达硕实验动物公司，许可证号：SCXK（川）：2019-29，体质量（106.17±8.52）g，范围为90～120g。常规饲养1周后开始实验。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。

1.2 实验药物、试剂与仪器

药物、试剂：注射用重组人IFN-γ（规格：50 万IU/瓶子，丽珠生物工程制药公司），4% 多聚甲醛（北京索莱宝科技公司），鸡卵清蛋白Ⅴ级（美国Sigma-Aldrich 公司），PCR 试剂盒（日本Takara 公司），IFN-γ、IgE、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、IL-4、IL-6 及IL-10（欣博盛生物科技公司），RNA 提取试剂盒（美国Invitrogen 公司），NF-B、TLR4 抗体（美国Cell signling 公司）。仪器：双垂直电泳槽（型号DYCZ-24D，北京六一仪器厂），台式高速离心机（型号Allegra X-30R，美国贝克曼库尔特公司），转印电泳槽（型号DYCZ-40D，北京六一仪器厂），MODEL550 酶标仪（美国BIO-RAD 公司），恒温水浴锅（上海福玛实验设备公司）。

1.3 研究方法

随机数字表法将大鼠分为实验组、正常组与模型组，每组20 只，模型组与实验组大鼠依据刘敏等方法制备AR 模型，1 mL 生理盐水内溶解0.3 mg卵清白蛋白（抗原）与30 mg AI（OH）（佐剂）制备为混悬液，腹腔注射以基础致敏，每次注射间隔1 d，共持续注射8 次。第16 天起，使用微量加样器将剂量为10 mg/100 L 的卵清白蛋白经鼻滴入50 L，持续7 d强化致敏。末次治疗后观察30 min内大鼠的打喷嚏与挠鼻状况，按照行为学指标评分，成功造模为评分≥5分。由第22天建立模型后，依据人和动物剂量转换公式，实验组大鼠采用20 IU 的重组人IFN-γ 滴鼻治疗，1 次/天，正常组与模型组采用等剂量生理盐水滴鼻，持续14 d。

1.4 观察指标

（1）行为学评分：各组大鼠由基础致敏到停止给药5 周内，在每周的末次给药0、0.5、1、2 h 对大鼠行为进行观察，依据行为学评分标准评分：不停擦鼻，清涕流至面部，喷嚏数≥11个计3分；两前肢挠鼻，清涕超出前鼻孔，喷嚏数4～10 个计2 分；单前肢偶有挠鼻，清涕流至前鼻孔，喷嚏数1～3 个计1分。（2）检测鼻黏膜组织：末次给药后处死大鼠，采用鼻腔暴露法将大鼠鼻腔外侧壁与鼻中隔呼吸区黏膜组织快速取出，10% 甲醛固定后酒精梯度脱水、透明，包埋后切片，厚度4 m，常规行HE 染色，观察大鼠鼻黏膜组织病理状况；每张病理切片随机选取高倍视野（10×40）5 个，计算大鼠鼻黏膜内肥大细胞与嗜酸粒细胞数量。（3）末次给药后，采集大鼠腹主动脉血清，室温下放置1 h，而后4 ℃、2 500 r/mim 离心10 min，选取上清液放置于EP管内，ELISA法检测血清IL-10、IFN-γ、IL-6、IgE、TNF-α、IL-4 含量。（4）RTPCR 检测鼻黏膜组织TLR4 与NF-B p65 mRNA 相对表达量：Trizol 提取细胞总RNA，TLR4 正向引物5’-GATCTAGCATCAGCTGTAC，反 向 引 物5’-GCAT‑CATCGTACGATCGAT-3’；NF-B p65 正向引物5’-GATCGATCAGTAGTCATGA-3’，反 向 引 物5’-GTAGCTCGATCGATCAGTC-3’；内参β-actin 正向引物5’-GACTAGCATCGATCATTA-3’，反向引物5’-GATCATGCTAGCATCTAGA-3’。 PCR 反应条件：92 ℃40 s，55 ℃450 s，74 ℃70 s，循环40 次后取TLR4与NF-B p65 mRNA 循环阈值（Ct），ΔΔCt（ΔΔCt=Ct 目的基因－ΔCt 内参基因）分析，计算2目的基因相对表达量。（5）蛋白质印迹法（Western blot‑ting）检测各组大鼠鼻黏膜组织内TLR4 与NF-B p65蛋白表达：常规提取细胞总蛋白，上样电泳，80 V 电压，溴酚蓝染料至分离胶提高电压为100 V，分离胶下泳出溴酚蓝结束电泳。PVDF膜内蛋白质电转移，30 mA 恒流，持续80 min。5%TBST 脱脂奶粉封闭PVDF 膜，震荡50 min。封闭结束后洗膜3 次， 10分钟/次，膜移至杂交袋，置入漂洗液稀释抗体，孵育过夜。洗膜3 次，10 分钟/次，置入过氧化物酶标记二抗，震荡50 min。ECL 显色液中将PVDF 膜温育6 min，分别曝光、显影、定影。冲洗后晾干扫描。

2 结果

2.1 各组大鼠行为学评分情况

实验组与模型组大鼠在基础致敏阶段状态良好，排便与饮食、饮水正常；药物激发3 d 后，实验组与模型组大鼠表征为毛发凌乱、烦躁易惊，激发完成后大鼠前鼻孔流出大量鼻涕，用前爪频繁挠鼻并打喷嚏，2 h 后部分大鼠症状有所缓解。强化致敏7 d 完成后，实验组大鼠行为学评分为（7.68±1.52）分，模型组为（7.81±1.43）分，均高于正常组的（2.95±0.57）分，差异有统计学意义（均

P

<0.05），说明成功建模。末次给药后实验组大鼠流涕、喷嚏和挠鼻等状况较模型组显著好转，行为学评分降低至（3.98±0.64）分，较模型组的（8.49±1.53）分差异有统计学意义（

P

<0.05）。

2.2 各组大鼠鼻黏膜病理状况

和正常组相比，模型组大鼠其鼻黏膜的假复层纤毛柱状上皮呈现连续性中断，纤毛发生倒伏且部分脱落，腺管变粗，基底细胞与柱状细胞剥脱，腺体变多，固有层内结缔组织增生，杯状细胞增生，并伴随大量炎症细胞浸润。实验组大鼠较模型组鼻黏膜上皮显著好转，固有层内炎症细胞数量大幅降低，肥大杯状细胞减少，扩张腺管与腺体接近正常。

2.3 各组大鼠鼻黏膜内肥大细胞与嗜酸粒细胞数量情况

模型组大鼠鼻黏膜内肥大细胞、嗜酸粒细胞数量较正常组升高，实验组大鼠鼻黏膜内肥大细胞、嗜酸粒细胞数量较模型组降低（

P

<0.05），见表1。

表1 各组大鼠鼻黏膜内肥大细胞与嗜酸粒细胞数量/（个/高倍视野，± s）

2.4 各组大鼠血清炎症因子含量情况

模型组大鼠血清IFN-γ、IL-10 含量低于正常组，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量高于正常组；实验组大鼠血清IFN-γ、IL-10 含量高于模型组，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量低于模型组（

P

<0.05），见表2。

表2 各组大鼠血清炎症因子含量对比/（ng/L，± s）

2.5 各组大鼠鼻黏膜组织TLR4 与NF-B p65 mRNA 表达情况

模型组大鼠鼻黏膜组织TLR4、NF-B p65 mRNA 相对表达量较正常组升高，实验组大鼠鼻黏膜组织TLR4、NF-B p65 mRNA相对表达量较模型组降低，差异有统计学意义（

P

<0.05），见表3。

表3 大鼠鼻黏膜组织TLR4与NF-B p65 mRNA表达对比/± s

2.6 各组大鼠鼻黏膜组织TLR4 与NF-B p65 蛋白表达情况

模型组大鼠鼻黏膜组织TLR4、NF-B p65蛋白表达较正常组升高，实验组大鼠鼻黏膜组织TLR4、NF-B p65 蛋白表达较模型组降低，差异有统计学意义（

P

<0.05），见表4。

表4 各组大鼠鼻黏膜组织TLR4与NF-B p65蛋白表达对比/± s

3 讨论

重组人IFN-γ 为一种生物制剂，多用于肝纤维化和类风湿关节炎等治疗，近些年来逐渐应用于AR 的治疗，其对于临床AR 病人有一定疗效，但相关机制研究较少。机体免疫内TLR 为哺乳动物细胞唯一能够把细胞外抗原信息传递至细胞内的跨膜蛋白，对识别病原体有重要的影响。TLR 多在哺乳动物免疫细胞表面表达，可对病原微生物生化内特定病原体特异性识别。呼吸道鼻黏膜内黏膜内皮细胞、树突状细胞、黏膜上皮细胞与巨噬细胞等分布着不同TLR 的亚型，而不同亚型对于特定微生物的感染源形成免疫应答。致敏原接触特应性个体后造成Th1/Th2 细胞因子网络的不平衡，在疾病发生中Th2 型细胞因子表达量升高，对疾病发生有重要影响。相关研究显示，采用脂多糖刺激哮喘小鼠，其机体内Th2含量明显升高，但在敲除TLR4 基因小鼠内Th2 含量却未明显上升。同时，TLR4 活化将NF-B 通路激活，NF-B 通路为介导细胞信号传递关键核转录因子，可经炎性介质、炎性相关因子和免疫调节间级联放大瀑布效应，在免疫反应与炎性反应中起到枢纽作用，对机体内多个信号通路传导有关键影响，参与了多种基因的调控与表达。

有报道称在AR 发病过程中TLR4/NF-B 信号通路起到了重要影响，TLR4 结合外源性配体将TLR4-MyD88 依赖性途径活化，激活NF-B 通路。NF-B亚基p65活化后可对转录元件直接作用将转录过程激活，进而启动系列免疫相关基因，包含趋化因子、黏附分子及前炎性介质等转录过程，增大其表达量，促进炎性细胞的浸润，加重或诱发炎症反应。另外，NF-B p65 活化后可将核内相关基因表达启动，造成Th1/Th2 失衡，Th2 细胞比例升高。本文研究显示，模型组大鼠鼻黏膜组织TLR4、NF-B p65 蛋白与mRNA 表达较正常组升高，实验组大鼠鼻黏膜组织TLR4、NF-B p65蛋白与mRNA表达较模型组降低，差异有统计学意义，说明重组人IFN-γ 可阻断AR 大鼠机体内TLR4/NF-B 信号通路的转导。AR 发生主要因素为Th1/Th2 失衡，其中Th2 可形成IL-10、IL-4 等细胞因子，介导体液免疫反应，Th1 则释放IFN-γ、IL-2 等，参与细胞免疫应答，Th1 所产生IFN-γ 是主要抗炎因子，抑制机体内IgE。而Th2 所形成的IL-4 等对变应性炎症反应有广泛影响，包括产生肥大细胞、形成黏液、嗜酸性粒细胞成熟、气道高反应性及生成IgE 等，同时，IL-4 可刺激IgE 基因重组与IgE 信使的RNA 转录，增大B 细胞所产生IgE的舒朗，机体免疫系统对于小量抗原的刺激发生免疫应答。本文研究显示，模型组大鼠血清IFNγ、IL-10 含量低于正常组，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量高于正常组；实验组大鼠血清IFN-γ、IL-10含量高于模型组，IgE、TNF-α、IL-4、IL-6 含量低于模型组，差异有统计学意义，说明重组人IFN-γ 可抑制炎症因子表达，纠正Th1/Th2的失衡状态。

综上所述，重组人干扰素γ 可降低变应性鼻炎大鼠血清炎症因子含量，减少生成IgE，调节T 细胞免疫失衡，其作用机制可能和抑制TLR4/NF-B 信号通路表达有关。