氯普鲁卡因通过调控长链非编码RNA TTN⁃AS1表达对胶质瘤细胞增殖和转移的影响

彭湃，杨军，邱勇

胶质瘤是常见的原发性脑肿瘤，其呈浸润性生长，易转移，其治疗方式仍以手术切除为主，同时辅以放、化疗，然而目前胶质瘤的治疗效果还不尽如人意。研究表明很多肿瘤病人在术后肿瘤易复发和转移，影响病人生存率，而麻醉药可影响肿瘤的微转移。氯普鲁卡因（chloroprocaine，CP）是一类新型的酯类高效局麻药，其起效快、效果确切、不良反应小、麻醉效应强，麻醉后恢复快的优点。研究报道CP可抑制人宫颈癌细胞HeLa和CaSki增殖，诱导抑癌基因上皮型钙黏蛋白1（epithelial cadherin 1，CDH1）、结肠腺瘤性息肉病基因（adenomatous polyp‑osis coli，APC）及P16启动子去甲基化。CP可抑制乳腺癌MDA-MB-231 细胞活力和迁移。Titin 反义RNA 1（titin antisense RNA 1，TTN-AS1）在肺腺癌的组织和细胞中上调，并与较差的总体生存率相关，TTN-AS1 可促进肺癌细胞的恶性生物学行为。TTN-AS1 在食管鳞状细胞癌组织和细胞系中高表达，并促进细胞增殖和转移。TTN-AS1 通过miR-573/E2F 转录因子3（E2F3）促进宫颈癌中的细胞生长和转移。以上研究表明CP 具有一定的抑癌作用，TTN-AS1也与癌症的增殖、转移相关，然而CP和长链非编码RNA（lncRNA）TTN-AS1 对胶质瘤细胞增殖和转移的影响还尚未可知。因此，本实验自2019 年6—11 月研究氯普鲁卡是否通过调控TTNAS1表达影响胶质瘤细胞的增殖和转移。

1 材料与方法

1.1 细胞与主要试剂

胶质瘤细胞株U251 购自上海冠导生物工程有限公司；RPMI-1640培养基、胎牛血清购自上海浩然生物技术有限公司；盐酸氯普鲁卡因购自上海广锐生物科技有限公司；噻唑兰（MTT）试剂盒、RIPA 蛋白裂解液购自美国Sigma；Transwell 小室、Matrigel、荧光定量PCR 试剂盒购于上海研卉生物科技有限公司。

1.2 细胞培养与分组

U251 细胞用RPMI-1640 培养液常规培养，取对数生长期细胞，分别用浓度为1 mmol/L、3 mmol/L、9 mmol/L 的CP 培养细胞作为CP低、中、高浓度组；未经任何处理的细胞作为对照组。将si-NC、si-TTN-AS1 转染至U251 细胞中，记为si-NC组、si-TTN-AS1组；将pcDNA、pcDNA-TTN-AS1转染至U251 细胞中再用9 mmol/L 的CP 培养，记为CP+pcDNA组、CP+pcDNA-TTN-AS1组。

1.3 MTT 法检测细胞增殖抑制率

细胞培养48 h，按试剂盒说明书操作，最后检测490 nm 处吸光度（OD）值；计算细胞增殖抑制率（%）。

1.4 蛋白质印迹（Western blotting）法检测蛋白表达

提取各组细胞总蛋白，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜、封闭，加入细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）等一抗（1∶1 000）4 ℃孵育过夜，再加入二抗（1∶2 000）室温孵育2 h，显影后分析蛋白条带的灰度值。

1.5 Transwell 检测细胞迁移和侵袭

迁移：将100 μL 细胞悬液加入Transwell 小室上室，培 养24 h，多聚甲醛固定，结晶紫染色，显微镜下观察并计数。侵袭：用Matrigel 包被Transwell 小室上室，然后与迁移操作一样。

1.6 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）检测lncRNA TTN-AS1表达水平

提取各组细胞总RNA，反转录成cDNA，按照试剂盒说明以GAPDH 为内参进行扩增，相对表达量用2法计算。

2 结果

2.1 CP 对胶质瘤U251 细胞增殖的影响

相较于对照组，低、中、高浓度CP 处理可提高U251 细胞增殖抑制率和p21 表达水平，降低CyclinD1 表达水平，且呈浓度依赖性（

P

<0.05）。见图1、表1。

图1 氯普鲁卡因（CP）对增殖相关蛋白的影响

表1 氯普鲁卡因（CP）对胶质瘤U251细胞增殖的影响/± s

2.2 CP 对胶质瘤U251 细胞迁移侵袭的影响

相较于对照组，低、中、高浓度CP处理可降低迁移侵袭数及MMP-2、MMP-9的表达水平，呈浓度依赖性（

P

<0.05）见图2、表2。

图2 氯普鲁卡因（CP）对基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达的影响

表2 氯普鲁卡因（CP）对胶质瘤U251细胞迁移侵袭的影响/± s

2.3 CP 对胶质瘤U251 细胞中lncRNA TTN-AS1表达的影响

相较于对照组（1.00±0.09），低（0.78±0.07）、中（0.65±0.06）、高（0.52±0.05）浓度CP 处理可降低TTN-AS1 表达水平，呈浓度依赖性（

F

=78.958，

P

=0.000）。

2.4 干扰lncRNA TTN-AS1表达对胶质瘤U251细胞增殖和转移的影响

相较于si-NC 组，干扰ln‑cRNA TTN-AS1 可提高细胞增殖抑制率和p21 表达水平，减少细胞迁移侵袭数，且降低CyclinD1、MMP-2、MMP-9表达水平（

P

<0.05）。见图3，表3。

表3 干扰lncRNA TTN-AS1表达对U251细胞增殖和迁移侵袭的影响/± s

图3 干扰lncRNA TTN-AS1表达对细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达的影响

2.5 lncRNA TTN-AS1 过表达逆转了CP（9 mmol/L）对胶质瘤U251 细胞增殖和转移的作用

相较于CP+pcDNA 组，CP+pcDNA-TTN-AS1 组细胞增殖抑制率和p21 表达水平降低，而迁移侵袭细胞数以及CyclinD1、MMP-2、MMP-9 表达水平升高（

P

<0.05）。见图4，表4。

图4 细胞周期蛋白D1（CyclinD1）、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A（p21）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白的表达

表4 lncRNA TTN-AS1过表达逆转了氯普鲁卡因（CP）（9 mmol/L）对胶质瘤U251细胞增殖和转移的作用/± s

3 讨论

复发和转移是目前肿瘤治疗的难点，手术是肿瘤治疗的基础和主要方式，研究表明局部麻醉药可影响某些肿瘤细胞的凋亡、增殖、转移。且研究报道麻醉药也可影响胶质瘤，研究麻醉药对胶质瘤侵袭迁移影响，可为围手术期合理应用麻醉药及改善病人预后提供新思路。有研究表明，普鲁卡因可抑制膀胱癌细胞增殖，诱导细胞凋亡，将肿瘤细胞阻滞于G0/G1期。罗哌卡因能抑制结肠癌细胞增殖和结肠癌皮下瘤的生长。利多卡因可抑制乳腺癌和前列腺癌细胞侵袭、迁移。以上研究表明，不同麻醉药均有一定的抑癌作用。本实验用不同浓度的CP 处理胶质瘤细胞U251 后，U251 细胞增殖抑制率升高，细胞迁移侵袭数减少；表明氯普鲁卡可抑制胶质瘤U251细胞增殖、迁移和侵袭。

研究表明lncRNA 也参与调节肿瘤的发生发展。研究报道lncRNA TTN-AS1 在甲状腺乳头状癌组织和细胞中高表达，其表达水平与淋巴转移、TNM 分期和病人的整体生存率有关，抑制TTN-AS1表达可抑制细胞增殖，迁移，侵袭和EMT。TTNAS1 高表达与肺腺癌病人的TNM 分期、淋巴结转移和术后预后差也有关，敲除TTN-AS1 可抑制肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭。沉默TNN-AS1 明显抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。沉默TTN-AS1 通过上调miR-1271 抑制前列腺癌的增殖和迁移。以上研究表明TNN-AS1 参与多种肿瘤的增殖和转移等过程，还与病人的生存及预后有关。本实验抑制TN-AS1抑制可提高细胞增殖抑制，降低细胞迁移侵袭数；说明抑制TTN-AS1 表达可抑制胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭。用不同浓度的CP处理胶质瘤细胞U251 后，TTN-AS1 表达水平显著降低；而过表达TTN-AS1 逆转了CP 对U251 细胞的作用。以上研究表明，CP 可能通过调控TTN-AS1 影响胶质瘤U251细胞的增殖、迁移和侵袭。

综上所述，CP 通过下调lncRNA TTN-AS1 表达可抑制胶质瘤细胞增殖和转移。