尾叶香茶菜丙素对肝癌耐药株HepG2/ADM细胞体外活性的影响

王欣玉，裴晓东，何志龙，林佳雯，黎永卓，陈文卿，刘小玲，蒋利和，3

恶性肿瘤是当今极难治愈的疾病之一，严重地威胁着人类的生命健康，是致死率第二高的疾病。其中肝癌作为第二大致死癌症，仅次于肺癌。目前，我国已成了全球肝癌发病率和死亡率最多的国家，每年肝癌发病约34.7 万人，占到全球的55%，死亡32.3 万人，占全球的45%，晚期肝癌病人只有大约15% 的人适合手术切除，多数病人选择放化疗治疗的方法。目前，化疗药物因其高毒性和耐药性使病人预后较差，祖国传统中药材具有多靶点低毒性的优点，因此人们期待在传统中草药中有应用前景的天然产物。

香茶菜属（

Isodon

）植物隶属唇形（Lamiaceae）科罗勒亚科（Ocimoideae），约有30 余种在我国和日本民间被广泛使用，它们大多具有清热解毒、抗炎抗菌及抗肿瘤等作用。其中尾叶香茶菜产于黑龙江、吉林及辽宁等地区，活性成分包括二萜类化合物尾叶香茶菜丙素（Kamebakaurin），尾叶香茶菜丙素对慢性骨髓性白血病（CML）有治疗活性，且对心、肝、脾、肺、肾5 个脏器无副作用，还可减少扑热息痛引起的肝损伤；在抑制肿瘤方面，可通过抑制HIF-1α 蛋白表达抑制结肠癌细胞HCT116 和SNu638 生长。但是在对耐药肿瘤方面还未见文献报道，因此本研究自2018 年11 月至2019 年11 月通过尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM 细胞的生长活力、迁移能力、细胞凋亡和周期的影响和可能机制，初步探明尾叶香茶菜丙素对耐药肝癌的应用潜力。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

尾叶香茶菜丙素购买于成都艾法公司，纯度99%；阿霉素购自上海生工，纯度99%。尾叶香茶菜丙素先用DMSO 溶解成200 μmol/L 浓度的母液，使用时用DMEM 稀释。胎牛血清购自美国GIBCO 公司，HepG2/ADM 细胞购自上海中科院细胞库，周期试剂盒购于联科公司，CCK-8 购于MCE 公司，凋亡试剂盒购于BD 生物公司，BCA 蛋白浓度测定试剂盒和蛋白上样缓冲液、RIPA 裂解液、蛋白酶抑制剂均购自索莱宝公司，PCR 引物由上海生工合成。抗体β-Tublin 多克隆抗体（货号10068-1-AP），p-AKT 多克隆抗体（货号66444-1-Ig），MDR1 多克隆抗体（货号22336-1-AP），Bax 多克隆抗体（货号50599-2-Ig），Bcl-2 多克隆抗体（货号12789-1-AP），AKT 多克隆抗体（货号10176-2-AP）GAPDH 多克隆抗体（货号60004-1-Ig），PTEN 多克隆抗体（货号22034-1-AP）均在Proteintech 购买；p-PTEN 单克隆抗体（货号AP0930）购自AbClon生物公司。

1.2 仪器与设备

DMI4000B 倒置荧光显微镜购于日本奥林巴斯公司；CO恒温培养箱购自Eppendorf AG；低温离心机购于广州吉迪仪器有限公司；BGPower 300电泳仪产自贝基恩生物科技有限公司。

1.3 细胞培养

HepG2/ADM 细胞用含10% 的胎牛血清、100 IU/mL 青霉素、100 mg/L 链霉素的高糖DMEM 完全培养基加入1 μg/mL 的阿霉素培养以保持细胞耐药性，于37 ℃，5% 二氧化碳细胞培养箱内培养。

1.4 CCK-8 试剂盒检测HepG2/ADM 细胞增殖活力

取分裂期细胞以5×10/mL接种在96孔板中，每孔100 μL，每个浓度梯度平行设4 个复孔。37 ℃，5% 浓度二氧化碳培养箱中培养24 h，更换用新鲜DMEM 稀释的含尾叶香茶菜丙素培养基或含阿霉素培养基，浓度梯度为培养24 h，后吸出培养基，加入浓度为10% 的含CCK-8 的新鲜的无血清DMEM，培养箱中孵育1 h后用酶标仪在450 nm 波长处测定吸光值。按下列公式计算各组药物对细胞的抑制率（inhibition rate，IR）=（1－药物组OD 值/细胞对照组OD值）×100%。实验重复3次结果取平均值。

1.5 细胞周期实验

将HepG2/ADM 细胞接种于六孔板中，密度为5×10个/毫升，生长密度达到70% 时加入混有尾叶香茶菜丙素的新鲜培养基，分为四组：空白组，40 μmol/L 组、60 μmol/L 组、80 μmol/L组。培养24 h后收集细胞加入按1∶100浓度混合的PI 染色缓冲液，每个样本加入500 μL 充分重悬细胞，37 ℃培养箱孵育25 min，上机检测。实验重复3次结果取平均值。

1.6 流式细胞仪检测HepG2/ADM 细胞凋亡

分裂期HepG2/ADM 细胞接种于6 孔板中，培养至密度70%后更换新鲜培养基并加入K，浓度分别为0、40、60、80 μmol/L。24 h 后收集细胞并用PBS 洗涤两次，1 200 r/min，3 min。吸出PBS 后每孔加入Bind‑ing Buffer 500 μL 重悬细胞，再加入5 μL Annexin VFITC 混合均匀，最后加入5 μL Propidium IAide。将细胞充分吹打散开后放入培养箱中37 ℃孵育15～30 min，取出后置于冰上，上机测定其凋亡率，重复3次取平均值。

1.7 Transwell 小室实验

消化收集分裂期的细胞，通过细胞计数吸取5 000 个细胞加入到小室中，其中上室200 μL 混有细胞的无血清培养基，下室500 μL 含有10% 血清的培养基。24 h 后停止实验，无水乙醇固定10 min，1% 浓度的结晶紫染色10 min，PBS 清洗两次每次8 min，之后进行常光拍照。实验重复3次结果取平均值。

1.8 细胞平板划痕实验

细胞接种于6 孔板，密度为5×10个/mL，待生长到密度90% 时用10 μL 白色枪头划线，每组画三条，用PBS清洗两次洗去浮起的细胞，加入混有尾叶香茶菜丙素的无血清培养基，设置四组为空白con 组、尾叶香茶菜丙素40 μmol/L组、60 μmol/L 组、80 μmol/L 组。在0、24、48 h 分别进行拍照记录。

1.9 实时荧光定量PCR

尾叶香茶菜丙素处理HepG2/ADM 细胞后24 h 提取RNA，之后RNA 反转为DNA，预变性95 ℃3 min，95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，95 ℃延伸30 s，总共40 个循环；之后69 ℃终延伸1 min。

1.10 蛋白质印迹法（Western blotting）

六孔板中细胞生长在70% 时将培养液换为混有尾叶香茶菜丙素的新鲜培养基，尾叶香茶菜丙素浓度为40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L。37 ℃继续培养24 h后吸出旧培养基，PBS 冲洗2 次加入RIPA 裂解液（RIPA∶蛋白酶抑制剂=1∶100），每孔加入200 μL。用细胞刮将细胞刮下后转移至EP 管中4 ℃冰上裂解40 min，每隔10 min 用手指弹管壁使细胞充分裂解。用BCA蛋白浓度试剂盒测定蛋白浓度，加入4X蛋白上样缓冲液沸水煮10 min，上样跑胶，转膜，5%脱脂奶粉或5%BSA 封闭，一抗4 ℃孵育过夜，1%TBST 洗膜3 次，二抗常温孵育70 min，洗膜3 次，上机显色拍照。

1.11 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件，计量资料采用

x ± s，

组间比较采用LSD-

t

检验，多组间比较采用单因素方差分析，

P

<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 尾叶香茶菜丙素可抑制HepG2/ADM 细胞的生长活力

为测定尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM细胞生长活力的影响，使用CCK-8 试剂盒测定，实验显示加入阿霉素浓度达到1.0 mg/mL 时对HepG2/ADM 细胞的抑制率只有26.5%（

n

=3），而加入尾叶香茶菜丙素后肝癌细胞HepG2/ADM 细胞生长活力下降明显（图1），说明尾叶香茶菜丙素可抑制HepG2/ADM细胞生长活性且呈浓度依赖性，IC50为（62.97 ±2.81）μmol/L（

n

=3）。同时，也表明尾叶香茶菜丙素对耐药ADM 的HepG2 细胞具有抑制作用。

图1 尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM细胞活力的影响（24 h）：A为尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM细胞抑制率；B为阿霉素对HepG2/ADM细胞的抑制率

2.2 尾叶香茶菜丙素将HepG2/ADM 细胞周期阻滞在G2 期

通过流式细胞仪测定HepG2/ADM 细胞在增殖不同时期的数目比例分布，结果表明随着尾叶香茶菜丙素浓度，HepG2/ADM 细胞被阻滞到G2 期，G2 期比例在空白组、40 μmol/L、60 μmol/L、80 μmol/L 分别增加（11.883±2.551）% 、（21.756±1.737）% 、（30.152±1.964）% 、（37.024±2.727）%（

n

=3），呈现浓度依赖性的趋势（

F

=1.821，2.380，2.516，

t

=6.189，5.221，4.287，

P

=0.041，0.033，0.0017）。

2.3 尾叶香茶菜丙素促进HepG2/ADM 细胞凋亡

利用流式细胞术分析不同浓度尾叶香茶菜丙素对细胞凋亡的影响，实验结果显示，在尾叶香茶菜丙素浓度分别为0、40、60、80 μmol/L 时，HepG2/ADM 细胞凋亡率分别为（6.267±1.317）%、（15.10±1.265）%、（19.77±1.963）%、（25.614±2.301）%（

n

=3），凋亡率呈递增趋势，说明尾叶香茶菜丙素能诱导HepG2/ADM 细胞凋亡，且呈浓度依赖性。Western blotting 结果显示Bcl-2 家族中促凋亡蛋白Bax 蛋白灰度值在尾叶香茶菜丙素浓度分别为0、40、60、80 μmol/L 时 分 别 为1、（1.24±0.072）、（1.63±0.128）、（2.19±0.183），说明Bax 蛋白表达上升，抑凋亡蛋白Bcl-2 在尾叶香茶菜丙素浓度分别为0、40、60、80 μmol/L 时 别 为1、（0.62±0.049）、（0.36±0.036）、（0.23±0.028），表达下降，显示尾叶香茶菜丙素通过调节Bcl-2家族蛋白表达发挥促凋亡作用（

F

=2.057，1.553，5.785，

t

=4.757，12.58，10.07，

P

=0.0089，0.002，0.005）。见图2。

图2 尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM细胞凋亡的促进作用

2.4 尾叶香茶菜丙素抑制HepG2/ADM 细胞迁移

为了研究尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM 细胞迁移的影响，研究进行了Transwell 小室实验和平板划痕愈合实验，发现在K 浓度为0、40、60、80 μmol/L时，穿过膜的细胞数量分别为［（832.56±38.91）、（617.85±26.71）、（436.23±31.52）、（361.69±27.13）］个，在平板划痕愈合实验中发现，24 h时划痕面积在K 浓度为0、40、60、80 μmol/L 分别是0 h 时的（0.68±0.012）、（0.83±0.021）、（0.90±0.019）、（0.95±0.010）倍；48 h 时划痕面积在K 浓度为0、40、60、80 μmol/L分别是0 h 时的（0.41±0.022）、（0.56±0.024）、（0.72±0.031）、（0.88±0.016）倍，说明随着尾叶香茶菜丙素浓度的升高，小室中穿过膜的细胞数量越来越少，划痕愈合的速率也呈浓度依赖性的变慢，说明尾叶香茶菜丙素可以抑制HepG2/ADM 细胞的迁移（t=12.61，9.82，P=0.003，0.005）。见图3。

图3 尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM细胞迁移的影响：A为Tran‑swell小室实验；B为平板划痕愈合实验

2.5 尾叶香茶菜丙素能抑制MDR1 在转录和翻译水平的表达

为了检测尾叶香茶菜丙素是否调控耐药基因的表达，我们首先进行了实时荧光定量PCR，表1 为引物合成表，结果显示，BCRP、MRP1、MRP2 都未受到显著调节，而在尾叶香茶菜丙素浓度为60 μmol/L 时MDR1 基因表达下调为空白对照的（0.255±0.013）倍（

t

=20.41，

P

=0.017）（

n

=3）。West‑ern blotting 结果显示MDR1 蛋白的表达量也受到了抑制，在尾叶香茶菜丙素处理浓度在80 μmol/L 时MDR1蛋白的浓度为空白对照组的（0.352±0.089）倍（

t

=19.87，

P

=0.008）（

n

=3），说明尾叶香茶菜丙素在转录和翻译两个水平都抑制了MDR1 的表达。见图4。

表1 引物设计和合成

图4 尾叶香茶菜丙素对ABC超家族转运蛋白mRNA和蛋白质表达的影响

2.6 尾叶香茶菜丙素抑制能p-PTEN 和p-AKT 的表达

另外，Western blotting 结果显示（图5），尾叶香茶菜丙素处理HepG2/ADM 细胞后p-AKT 蛋白表达量下降在80 μmol/L 时p-AKT 蛋白表达量降至空白组的（0.231±0.036）倍（

t

=15.49，

P

=0.002），p-PTEN表达量上升，在60 μmol/L时上升为空白组蛋白表达量的（1.523±0.126）倍（

t

=7.189，

P

=0.002）且这些蛋白全部以浓度依赖性的方式受到调节。

图5 尾叶香茶菜丙素对PENT-AKT通路蛋白的调控

3 讨论

肝癌耐药性一直是其化疗效果不佳和预后较差的重要原因，本研究发现阿霉素在1 mg/mL（184 μmol/L）时对HepG2/ADM 细胞耐药株的生长抑制率只有26.5%，而尾叶香茶菜丙素（Kamebakurin）对肝癌细胞HepG2/ADM细胞生长活力有强抑制作用，其IC50 值为62.97 μmol/L，尾叶香茶菜丙素对HepG2/ADM细胞的毒性要高于一线药物ADM。

在细胞凋亡主动中Bcl2 家族发挥重要作用，尾叶香茶菜丙素能诱导HepG2/ADM 细胞凋亡，蛋白免疫印迹结果显示尾叶香茶菜丙素通过上调促凋亡蛋白Bax 的表达并抑制抑凋亡蛋白Bcl-2 表达；尾叶香茶菜丙素可将HepG2/ADM 细胞周期阻滞在G2期，说明尾叶香茶菜丙素使细胞DNA 损伤，细胞G2检查点将受损细胞阻滞在G2 期无法进行后续有丝分裂，是HepG2/ADM 细胞发生凋亡和生长活力下降的主要原因之一；癌细胞的高迁移能力，是癌症难以治愈的重要原因之一，我们的研究表明尾叶香茶菜丙素具有很强的抑制HepG2/ADM 细胞迁移的能力。MDR1在癌细胞中过表达是肿瘤化疗成功的主要障碍之一，在肿瘤病人中，MDR1 将化疗药物排出细胞外，使药物疗效下降。在本研究中，尾叶香茶菜丙素处理细胞后，MDR1 在mRNA 和蛋白水平上显著降低，逆转了HepG2/ADM 细胞耐药株将药物泵出细胞的能力，说明尾叶香茶菜丙素具有逆转HepG2/ADM 细胞耐药的潜力，其部分功能通过抑制MDR1 基因和蛋白的表达发生，可能这是HepG2/ADM 细胞对尾叶香茶菜丙素要比阿霉素更敏感的原因之一。AKT 通路与很多肿瘤的发生相关，其异常激活会促进肿瘤的生长增殖以及迁移侵袭等，PTEN 是一种新发现的抑癌基因，作为AKT 通路的负调控因子其磷酸化水平的升高会抑制p-AKT 的激活从而抑制细胞增殖和迁移。通过Western blotting 实验显示尾叶香茶菜丙素处理细胞后，p-AKT含量下降且AKT通路上游蛋白p-PTEN表达上升最终抑制AKT通路的激活。

综上所述，尾叶香茶菜丙素可能通过抑制MDR1 蛋白表达从而逆转HepG2/ADM 细胞对药物的敏感性，主要通过上调p-PTEN抑制p-AKT的激活从而促进HepG2/ADM 细胞的凋亡并抑制其迁移能力，说明尾叶香茶菜丙素具有很好的抑制肝癌耐药的功效和潜力。