病毒性脑炎病儿脑脊液中微小RNA-21表达水平与辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的相关性分析

葛莉，朱丽

病毒性脑炎是一种中枢神经系统感染性疾病，以颅压增高、发热、精神及意识障碍等临床症状为突出表现，以脑实质为主要病理改变，在儿童及成人中均可发病，但多见于儿童群体。病毒性脑炎的发病与病毒感染有关，其中，可引起本病的病毒高达一百多种。而流行病学显示，病毒性脑炎表现出流行性、散发性特点，发病率可达7/10 万，若救治不及时，轻者遗留后遗症，重者可导致患者死亡，这给其家庭带来了巨大的心理负担。因此，探求病毒性脑炎可能的发病机制、干预靶点一直是研究者们的重要研究内容。辅助性T 细胞17（helper T cell 17，Th17）、调节性T 细胞（regulatory T cell，Treg）是T细胞中免疫应答功能不同的两种类型，彼此存在拮抗关系，已有研究表明病毒性脑炎患者体内Th17/Treg 处于失衡状态。microRNA-21（miR-21）是mi‑croRNA 的一种，能通过多种方式影响免疫细胞的生长、分化，但这一点在病毒性脑炎中尚未得到证实。本研究拟通过检测病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21 表达水平及Th17、Treg 细胞比例，分析脑脊液miR-21水平与Th17/Treg平衡的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017 年9 月至2019 年7 月在抚顺市中心医院儿科就诊的急性期病毒性脑炎病儿（观察组）108 例作为研究对象，根据临床症状、体征和辅助检查结果进一步分为两亚组：轻症组（轻症病毒性脑炎病儿，57 例）和重症组（重症病毒性脑炎病儿，51 例），选取同期抚顺市中心医院儿科出院前复查已康复的病毒性脑炎病儿（对照组）110 例作为对照。收集两亚组、对照组性别、年龄等一般资料。

纳入标准：（1）病毒性脑炎的诊断标准与《传染病学（第8 版）》中有关描述相符，其中，当病毒性脑炎病儿符合频繁抽搐或惊厥持续、肢体瘫痪症状、头部CT/MR 检查提示脑干出现异常密集灶或脑实质、意识障碍中至少两条描述时，纳入重症组，否则纳入轻症组。（2）所有受试儿童监护人对本研究知情并签署纸质版知情同意书。

排除标准：（1）患有恶性肿瘤、血液系统疾病、免疫系统疾病、生长发育异常、中枢神经系统病变、先天性心肝肾功能异常及其他颅脑病变病儿。（3）近期使用糖皮质激素、免疫抑制剂等药物。（4）不服从检测安排者。（5）资料不真实或不全者。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

1.2 试剂与仪器

实时荧光定量聚合酶链式反应（real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction，qRT-PCR）仪（型号：ABI 7500 Sequence De‑tection System）购自美国Applied Biosystems 公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。人白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）酶联免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）试剂盒（货号EK0410、EK0416、EK0430）购自上海彩佑实业有限公司；人转化生长因子-β（TGF-β）ELISA 试剂盒（货号C505058）购自生工生物工程（上海）股份有限公司；酶标仪（型号MODEL550）购自美国Bio-Rad 公司；流式细胞仪（型号FACS CantoⅡ）购自美国BD公司；流式细胞仪采用的流式抗体均购自美国eBio‑science公司。

表1 引物序列表

1.3 脑脊液采集及指标检测

所有受试者均行无菌腰椎穿刺术，常规抽取脑脊液分成3份待检。

一份qRT-PCR法检测miR-21相对表达量，试剂盒法提取总RNA，反转录成cDNA，以U6 为内参，荧光定量PCR 检测miR-21 相对表达量，每个样本3 次重复，2法计算miR-21相对表达量。

一份采用ELISA 法检测IL-6、IL-10、IL-17、TGFβ 水平，试验方法均按照试剂盒说明书进行。酶标仪于波长450 nm 处测定吸光度（值，3 次重复，绘制标准曲线，根据样品OD 值计算IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β水平。

一份流式细胞仪分析Treg、Th17 细胞水平，密度梯度离心法提取单个核细胞（peripheral blood mono-nuclear cell，PBMCs），PBS 重悬PBMCs 细胞，取细胞悬液20 μL 分成2 份，调节细胞浓度后分别加入流式细胞仪抗体，其中，Treg管的单克隆抗体采用Foxp3 Alexa Fluor488/CD25 PE/CD4 PerCP，Th17管的单克隆抗体采用IL-17 Alexa Fluor647/CD3 FITC/CD4 PE，试验方法均严格按照流式细胞检测说明书进行，流式细胞仪上检测Treg细胞和Th17细胞水平，结果用FACS Express 3.0 软件分析，计算Treg、Th17和Treg/Th17。

2 结果

2.1 病儿一般资料比较

对照组与观察组，轻症组与重症组受试儿童性别、年龄均差异无统计学意义（

P

>0.05），具有可比性。见表2，3。

表2 病毒性脑炎对照组与观察组一般资料比较

表3 病毒性脑炎轻症组与重症组一般资料比较

2.2 两组脑脊液中miR-21、Th17、Treg、Th17/Treg水平比较

与对照组比较，观察组脑脊液中miR-21、Th17、Th17/Treg 水平明显升高（

P

<0.05），Treg 水平明显降低（

P

<0.05）。见表4。

表4 病毒性脑炎对照组与观察组脑脊液中微小RNA-21（miR-21）、辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）、Th17/Treg水平比较/± s

2.3 两组脑脊液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平比较

研究结果显示，与对照组比较，观察组病毒性脑炎病儿脑脊液中IL-6、IL-17 水平明显升高（

P

<0.05），IL-10、TGF- β水平明显降低（

P

<0.05）。见表5。

表5 病毒性脑炎对照组与观察组脑脊液中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）、转化生长因子-β（TGF-β）水平比较/（ng/L，± s）

2.4 不同严重水平病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21、Th17、Treg、Th17/Treg 水平比较

与轻症组相比，重症组病儿脑脊液中miR-21、Th17、Th17/Treg水平明显升高（

P

<0.05），Treg 水平明显降低（

P

<0.05）。见表6。

表6 病毒性脑炎轻症组与重症组脑脊液中微小RNA-21（miR-21）、辅助性T细胞17（Th17）、调节性T细胞（Treg）、Th17/Treg水平比较/± s

2.5 不同严重水平病毒性脑炎病儿脑脊液中IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平比较

与轻症组相比，重症组脑脊液中IL-6、IL-17 水平明显升高（

P

<0.05），IL-10、TGF-β水平明显降低（

P

<0.05）。见表7。

表7 病毒性脑炎轻症组与重症组脑脊液中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）、转化生长因子-β（TGF-β）水平比较/（ng/L，± s）

2.6 病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21、Th17/Treg水平与IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平的相关性

相关性分析结果显示，病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21 水平、Th17/Treg 水平与IL-6、IL-17 水平均明显正相关（

P

<0.05），与IL-10、TGF-β 水平均明显负相关（

P

<0.05）。见表8。

表8 病毒性脑炎病儿脑脊液中微小RNA-21（miR-21）、辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）水平与白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）、转化生长因子-β（TGF-β）水平的相关性分析

2.7 病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21 水平与Th17/Treg 的相关性

相关性分析结果显示，病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21 水平与Th17/Treg 明显正相关（

r

=0.553，

P

<0.05）。见图1。

图1 病毒性脑炎病儿脑脊液中微小RNA-21（miR-21）与辅助性T细胞17（Th17）/调节性T细胞（Treg）的相关性分析

3 讨论

病毒性脑炎是儿科常见疾病，当病儿机体抵抗力低时，病毒可侵犯人体中枢神经系统，对中枢神经组织细胞造成损害。其中，病毒对机体的损害机制可具体分为直接损害和间接损害，直接损害为病毒及其释放的毒素对脑组织、脑细胞造成的损伤，间接损害为病毒及其释放的毒素激活颅内免疫应答反应后，产生的大量炎性因子对局部脑组织、脑细胞造成的损害。有研究表明，与直接损害相较，间接损害对治疗后不良事件发生的影响更为严重。T细胞是人体主要的免疫细胞，参与病毒感染机体后的免疫应答反应，而CD4T 细胞作为T 细胞的重要类型，在病毒及其释放的毒素刺激下可分化为多个亚群，其中，Th17、Treg 是维持免疫稳定、免疫耐受过程的两个重要亚群，彼此联系紧密，功能相互抑制，当机体运行正常时保持动态平衡，共同维持机体的免疫内环境稳定，当免疫应答激活后，Th17/Treg 状态失衡引起炎症反应，参与疾病发病后的免疫调控。

有研究表明，初始T 细胞分化发育方向受制于所处周围环境，当机体周围环境中IL-1β、IL-6 和TGF-β 浓度处于高水平时，初始T 细胞分化发育方向趋向于Th17 细胞，由Th17 细胞调控分泌的IL17、IL-6、IL-23 等细胞因子随之增加；当周围环境中只有TGF-β 处于高水平时，初始T 细胞分化发育方向趋向于Treg 细胞，由Treg 细胞调控分泌等IL-4、IL-10、TGF-β 细胞因子随之增加。本研究中，随着病毒性脑炎的发生与病情的加重，患者脑脊液中Treg、IL-10、TGF-β 水平明显降低，Th17、Th17/Treg、IL-6、IL-17 水平明显升高，且Th17/Treg 与IL-10、TGF-β 水平明显负相关，与IL-6、IL-17 水平明显正相关，这表明病毒性脑炎患者体内存在免疫调控，Treg、Th17、IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 均参与其中。Zhang 等研究表明，IL-6 是决定Th17、Treg 分化相对比例的重要细胞因子，本研究结果与之一致。且IL-6 水平升高导致初始T 细胞向Th17 细胞分化后，进一步导致由Th17 分泌的IL17、IL-6 水平升高，由Treg 分泌的IL-10、TGF-β 水平水平降低，如此循环往复，Th17/Treg呈现出失衡状态。

miR-21 是非编码小片段RNA 分子miRNA 中的一员，与自身免疫性疾病、癌症、肾脏疾病、心血管疾病、炎症相关性疾病中均密切相关。谢子英等研究发现，miR-21 与急性胰腺炎患者细胞内感染程度、免疫应答、炎症反应具有相关性，推测miR-21表达上调可影响机体全身性炎症反应爆发，导致IL-6、IL-8、TNF-α 等炎性因子的过量释放。姚绍鑫等研究表明，肝癌大鼠外周血miR-21 水平上调，与Treg/Th17比值明显正相关，但具体分子生物学调控机制未知。但在于海奕等人的研究中，大鼠心肌细胞IL-6 水平增加后，可通过增强STST3 活性促进miR-21 的转录表达，共同参与心室重构。本研究中，随着病毒性脑炎的发生与病情的加重，患者脑脊液中miR-21 水平明显升高，与IL-10、TGF-β 水平明显负相关，与IL-6、IL-17、Treg/Th17水平明显正相关，这表明miR-21参与病毒性脑炎的发生及病情加重过程，与IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β、Treg/Th17 均有明显的相关关系。结合前人研究，本研究结果表明，病毒性脑炎脑脊液中miR-21 表达上调，可能与IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 水平相互影响，共同参与免疫调控，即Th17/Treg的失衡过程。

综上所述，病毒性脑炎病儿脑脊液中miR-21表达水平、Th17/Treg 均明显增加，两者明显正相关，miR-21 水平升高可能对Th17/Treg 失衡有促进作用。虽然研究结果表明，miR-21 对Th17/Treg 失衡的影响可能有IL-6、IL-10、IL-17、TGF-β 的参与，但具体机制尚需进一步研究。