微小RNA-15a-5p靶向蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭

向从明，陈友干，孙承文，张笑，吴国胜

前列腺癌是男性常见的恶性肿瘤之一，目前前列腺癌发生及转移的分子机制尚未阐明。miR‑NA 是一种非编码小分子RNA，其可介导参与细胞增殖、凋亡等生物学行为，从而影响肿瘤发生及发展。 微 小RNA-15a-5p（microRNA-15a-5p，miR-15a-5p）在乳腺癌细胞中表达下调，并可促进细胞增殖、迁移及侵袭。通过生物信息学分析显示蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（protein disulfide isom‑erase A6，PDIA6）可 能 是miR-15a-5p 的 靶 基 因，PDIA6 在非小细胞肺癌细胞中表达上调，并可促进非小细胞肺癌发展进程。因此，本研究主要研究miR-15a-5p在前列腺癌组织中的表达及其对病人前列腺癌细胞增殖、迁移、侵袭等生物学过程的作用，及其可能相关的作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

标本来源：选取2018 年2 月至2019年3月江南大学附属医院泌尿外科接受治疗的前列腺癌病人50例，所有病人均经病理学确诊为前列腺癌，年龄（66.59±6.35）岁，将手术切除的前列腺癌组织、癌旁组织置于-80 ℃超低温冰箱保存。前列腺癌DU145细胞由美国ATCC公司生产；Triolz和荧光定量检测试剂盒由北京天根生化科技有限公司生产；miR-15a-5p 寡核苷酸模拟物（miR-15a-5p mimics）及阴性对照mimic NC 序列（miR-NC）、PDIA6 小分子干扰RNA（si-PDIA6）及其阴性对照（si-NC）、miR-15a-5p 特异性寡核苷酸抑制剂（antimiR-15a-5p）及阴性对照inhibitor NC 序列（antimiR-NC）由广州锐博生物科技有限公司生产；Lipo‑fectamine2000 由美国Invitrogen 公司生产；MTT、二甲基亚砜（DMSO）由美国Sigma 公司生产；兔抗人PDIA6抗体由武汉维克赛思科技有限公司生产。

1.2 方法

1.2.1 实验分组

DU145 细胞接种于6 孔板（3×10个/孔），按照脂质体法分别将miR-NC、miR-15a-5p mimics、si-NC、si-PDIA6、miR-15a-5p mimics 和pcD‑NA、miR-15a-5p mimics 和pcDNA-PDIA6 转染至DU145细胞，分别记作miR-NC组、miR-15a-5p组、si-NC组、si-PDIA6组、miR-15a-5p+pcDNA组、miR-15a-5p+pcDNA-PDIA6 组。转染6 h 后更换为含有胎牛血清的培养基，继续培养48 h。

1.2.2 miR-15a-5p、PDIA6 mRNA 的检测

将冻存前列腺癌组织和癌旁组织取出，各组DU145 细胞总的RNA 提取采用Trizol试剂。其过程严格按照试剂盒说明书执行，将反转录合成cDNA，用cDNA 为模板行荧光定量反应，并计算miR-15a-5p、PDIA6 mRNA水平。

1.2.3 细胞增殖的检测

将各组DU145 细胞接种于5×10个/孔的96 孔板，并每孔加入20 μL MTT 溶液，然后静置培养4 h，弃其上清，每孔加入150 μL的DMSO，采用全自动酶标仪对吸光度值（OD 值）检测测定。

1.2.4 细胞迁移与侵袭的检测

将对数生长期的3×10个/毫升DU145 细胞分别每孔加入150 μL 上室，按照“1.2.1”分组处理，下室每孔加入完全600 μL 培养液，然后继续培养24 h，使用多聚甲醛将其固定20 min 后，用0.1% 结晶紫染液染色10 min，采用倒置显微镜观察迁移的细胞数。采用完全培养基稀释的Matrigel 基质胶，然后将Transwell小室上室每孔加入40 μL，置于培养箱内孵育5 h后，重复上述步骤。

1.2.5 miR-15a-5p 的靶基因的检测

采用starBase在线数据库预测显示miR-15a-5p 与PDIA6 存在的结合位点，构建野生型载体和突变型载体（WTPDIA6、MUT-PDIA6），将miR-NC、miR-15a-5p mim‑ics 分别与WT-PDIA6、MUT-PDIA6 共转染至DU145细胞，继续培养24 h，检测细胞荧光素酶活性。

1.2.6 PDIA6、Ki-67、增殖细胞核抗原（PCNA）、基质金属蛋白酶2（MMP-2）、基质金属蛋白酶9（MMP-9）蛋白表达的测定

取各组DU145 细胞，使用400 μL RIPA 裂解液提取细胞总蛋白，采用BCA 法对蛋白浓度进行检测，采用SDS-PAGE 凝胶电泳反应将蛋白分离，然后蛋白迅速转膜，并封闭1 h，分别加入PDIA6（1∶800）、Ki-67（1∶800）、PCNA（1∶800）、MMP-2（1∶1 000）、MMP-9（1∶1 000）与内参GAPDH 一抗稀释液（1∶1 000）（美国Santa Cruz），4 ℃孵育24 h，TBST 洗涤，分别加入二抗稀释液（1∶5 000）（美国Abcam），室温孵育1 h，滴加ECL，显影。应用Quan‑tityone软件检测条带灰度值。

2 结果

2.1 miR-15a-5p 和PDIA6 在前列腺癌组织中的表达量比较

与癌旁组织比较，miR-15a-5p 在前列腺癌组织中的表达水平降低（

P

<0.05），而PDIA6 mRNA及蛋白水平升高（

P

<0.05），见图1、表1。

图1 蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）在前列腺癌组织中的表达

表1 微小RNA-15a-5p（miR-15a-5p）与蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）在前列腺癌组织中的表达量比较/± s

2.2 miR-15a-5p 过表达抑制前列腺癌DU145 细胞增殖、迁移及侵袭

与miR-NC 组比较，miR-15a-5p组中细胞存活率、迁移细胞数与侵袭细胞数降低（

P

<0.05），Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（

P

<0.05）。见图2、表2。

表2 miR-15a-5p过表达对前列腺癌DU145细胞增殖、迁移及侵袭的影响/（± s，n=9）

图2 Western blotting法检测Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的表达量

2.3 抑制PDIA6 对前列腺癌DU145 细胞增殖、迁移及侵袭的影响

与si-NC组比较，si-PDIA6组细胞存活率、迁移细胞数与侵袭细胞数降低（

P

<0.05），Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平降低（

P

<0.05）。见图3、表3。

图3 Western blotting法检测PDIA6、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9的表达量

表3 抑制蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）表达对前列腺癌DU145细胞增殖、迁移及侵袭的影响/（± s，n=9）

2.4 miR-15a-5p 靶向调控PDIA6

PDIA6 的3’UTR 中含有与miR-15a-5p 互补的核苷酸序列，见图4。miR-15a-5p 过表达可降低WT-PDIA6 的荧光素酶活性（

P

<0.05），见表4。miR-15a-5p过表达可降低PDIA6 蛋白水平，抑制miR-15a-5p 表达可提高PDIA6蛋白水平（

P

<0.05），见图5、表5。

表5 miR-15a-5p靶向调控蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）的表达/（± s，n=9）

图4 miR-15a-5p和蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）互补的核苷酸序列

图5 蛋白质印迹法（Western blotting）法检测蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）蛋白表达量

表4 双荧光素酶报告实验/（± s，n=9）

2.5 PDIA6 过表达降低miR-15a-5p 过表达对前列腺癌DU145 细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用

与miR-15a-5p+pcDNA 组比较，miR-15a-5p+pcDNAPDIA6 组细胞存活率、迁移细胞数与侵袭细胞数升高（

P

<0.05），Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平升高（

P

<0.05）。见图6、表6。

图6 Western blotting法检测PDIA6、Ki-67、PCNA、MMP-2、MMP-9蛋白表达量

表6 蛋白质二硫键异构酶A6前体蛋白（PDIA6）过表达降低miR-15a-5p过表达对前列腺癌DU145细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用/（± s，n=9）

3 讨论

我国前列腺癌发病率与死亡率逐年增加，已成为威胁男性健康的主要疾病，miRNA 可通过靶向调控下游mRNA 表达从而在前列腺癌等肿瘤发生及发展过程中发挥癌基因或抑癌基因作用。

miR-15a-5p 通过抑制WNT3A 表达而抑制子宫内膜癌细胞的生长。长链非编码RNA HOXA 簇反义RNA2（LncRNA HOXA-AS2）通过调节miR-15a-5p / 同源基因A-3（HOXA3）分子轴而促进乳头状甲状腺癌的发生及发展。还有研究结果发现，miR-15a-5p 通过靶向脑源性神经营养因子（BDNF）对肝细胞癌细胞增殖有抑制作用。本研究结果显示，miR-15a-5p在前列腺癌组织中表达水平降低，过表达miR-15a-5p 降低细胞存活率，提示过表达miR-15a-5p可抑制前列腺癌细胞增殖。研究表明细胞增殖相关蛋白Ki-67、PCNA 在肿瘤中表达上调，并可促进肿瘤细胞增殖。本研究结果显示miR-15a-5p 过表达后前列腺癌细胞中Ki-67、PCNA 的表达水平降低，进一步证实miR-15a-5p 过表达可减弱前列腺癌细胞增殖能力。本研究结果显示，过表达miR-15a-5p 可减少迁移细胞数与侵袭细胞数，提示miR-15a-5p 过表达可抑制前列腺癌细胞迁移及侵袭。

下调PDIA6 表达可抑制膀胱癌细胞增殖及侵袭。miR-376a 可通过抑制PDIA6 表达从而在骨巨细胞瘤发生过程中发挥抑癌作用。PDIA6 表达上调可促进原发性导管癌细胞侵袭。本研究结果显示前列腺癌组织中PDIA6 的表达水平显著升高，抑制PDIA6 表达可显著降低前列腺癌细胞存活率及抑制细胞迁移、侵袭，miR-15a-5p可靶向结合PDIA6，PDIA6 过表达可减弱miR-15a-5p 过表达对前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。

综上所述，miR-15a-5p 过表达通过靶向PDIA6抑制前列腺癌细胞增殖、迁移及侵袭，可为前列腺癌的分子诊断及治疗提供潜在靶点，但关于其具体作用机制及其可能涉及的相关信号通路尚需进一步探究。