核因子κB及Nrf2在胎粪吸入急性肺损伤新生大鼠肺组织中的表达变化

刘文静，张昕，陈彤，崔秀杰，王爱红，王鑫，王东关，于丽

胎粪吸入综合征（meconium aspiration syn‑drome，MAS）是新生儿肺损伤最严重的形式之一，起病原因是缺氧时胎儿产生呼吸运动将胎粪吸入气管内或肺内，临床特点是生后出现呼吸窘迫，可并发肺动脉高压和气漏，它能促进肺组织炎症的发生、气道阻塞、肺表面活性物质产生减少。细胞核因子κB（Nf-κB）信号通路被认为是细胞因子产生、黏附分子调节和急性期蛋白合成的决定性机制。许多内源性和外源性刺激可诱导Nf-κB 的产生。有实验证实抑制Nf-κB 的活化可减轻急性肺损伤（acute lung jnjury，ALI）中肺组织的损伤和炎症反应。Nf-κB可作为一个控制如败血症、哮喘及急性肺损伤等炎症性疾病的有效药物靶点。Nrf2 是氧化应激反应中重要的转录激活因子，是外源性有毒物质和氧化应激的感受器，在细胞防御中Nrf2 处于核心地位。当Nrf2 发生缺失或激活障碍时，会使细胞处于氧化应激状态，易发生炎症修复延缓、细胞凋亡、甚至癌症。有动物实验证实磺胺多辛通过上调Nrf2 表达对家兔ARDS 具有显著的抗炎作用。有研究证实双氢青蒿素通过激活Nrf2 抑制Nf-κB 信号途径，发挥抗炎和抗氧化作用；实验证实Nrf2 负性调节脂多糖诱导的NF-κB 信号激活。已有研究证实Nrf2信号通路的激活可抑制Nf-κB 的激活和炎症反应。但尚未有实验证实Nf-κB 在胎粪诱导肺损伤中发挥作用是否依赖信号分子Nrf2的激活。本研究自2020 年1―6 月应用胎粪诱导的新生大鼠肺损伤模型，阐述Nf-κB 及Nrf2 在新生大鼠肺损伤模型中的作用机制及其与肺损伤严重程度的关系。

1 材料与方法

1.1 动物模型

大鼠30 只，鼠龄范围为2～3 周，体质量范围为79～100 g，由济南市朋悦实验动物有限公司提供［批号SCXK（鲁）20190003］，动物实验通过了东营市人民医院动物实验伦理委员会审批［编号（2018）伦研批（89）号］。采用随机数字表法分为三组，分别为胎粪组、生理盐水+胎粪组、生理盐水组，三组大鼠体质量差异无统计学意义（

P

>0.05）。实验动物购买后在实验室适宜环境下饲养，室温控制在（22±2）℃，自由光照，相对湿度为40%～60%。

1.2 胎粪混悬液的配置

收集东营市人民医院产科经病儿近亲属同意后足月健康新生儿第一次胎粪，真空冷冻干燥，研磨成细粉。在实验之前，用生理盐水稀释成60 mg/mL 的胎粪混悬液，分装后，于-20 ℃冰箱保存，胎粪培养为无菌状态。

1.3 干预措施

采用Zagariya 等的方法，胎粪组大鼠腹腔注射2 %戊巴比妥钠40 mg/ kg，麻醉后置于动物解剖台上，仰卧位固定，完善气管插管，导管内注入1 mL/kg 的胎粪混悬液，胎粪注入后给予气管导管内推注约2～3 mL空气确保胎粪注入气管内，拔出气管导管。实验动物清醒后给予吸氧处理，并自由进食及饮水。生理盐水组给予新生大鼠气管插管内注入1 mL/kg 的无菌生理盐水，其它操作步骤同胎粪组；生理盐水+胎粪组给予新生大鼠气管导管内注入0.5 mL/kg 生理盐水+0.5 mL/kg 胎粪，并观察8 h，观察过程中胎粪组死亡1 只，再次造模，保证每组成功造模数均为10只。

1.4 标本的采集与处理

各组大鼠观察8 h，麻醉后依次心脏放血处死，取肺组织，生理盐水冲洗干净后，10% 左多聚甲醛固定24 h，乙醇梯度脱水，二甲醛透明，石蜡包埋，于切片机上连续性切片，厚度4 μm，每隔10片取1片，各标本取10片，贴片后标记以做备用。

1.5 免疫组化

Nf-κB 抗体（编号KF742）、Nrf2 抗体（编号KF324）、免疫组化试剂盒均由上海建成工程有限公司提供。实验动物常用试剂、解剖台、留置针及实验耗材等均由潍坊医学院泰山学者实验室提供。将石蜡切片于40 ℃恒温烤箱中放置30 min，依次脱蜡、水化，抗原修复、双氧水阻断内源性过氧化物酶，加用一抗后孵育过夜，DBA 染色后脱水、透明并封片。

1.6 酶联免疫吸附（ELISA）检测

准确称取肺组织在2 500 r/min 离心机上离心10 min 取上清液，用生理盐水稀释10倍作为样本；取上述样本应用标准品稀释液稀释成不同浓度标准品稀释液，应用ELI‑SA测定三组组织中Nf-κB、Nrf2的含量。

1.7 统计学方法

光学显微镜下观察组织阳性表达的细胞，阳性产物分布于细胞核内，实验结果用SPSS 20 统计软件分析，

q

检验，三组肺组织切片的Nf-κB、Nrf2 阳性表达情况比较用

χ

检验，

P

<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理学改变

肉眼观胎粪组可见肺组织外观较饱满，部分肺组织可见斑块状、点状出血灶，生理盐水+胎粪组可见肺组织外观略水肿，无明显肺出血表现；胎粪组HE 染色可见脱落的上皮细胞、胎粪样颗粒物，肺泡大小不一、肺泡壁及肺泡腔内可见出血，并伴有大量炎性细胞浸润；生理盐水+胎粪组可见散在炎症细胞浸润、肺泡壁及肺泡腔少许出血，见少量脱落上皮细胞；生理盐水组肺泡组织大小一致，少许炎症细胞浸润。见图1。

2.2 三组肺组织中Nf-κB、Nrf2 免疫组化表达情况

胎粪组肺组织中Nf-κB 表达水平比胎粪+生理盐水组高，胎粪+生理盐水组中表达水平比生理盐水组高，均差异有统计学意义（

P

<0.05）；胎粪组肺组织中Nrf2 表达水平高于胎粪+生理盐水组，在胎粪+生理盐水组中的表达明显高于生理盐水组，均差异有统计学意义（

P

<0.05）。见表1，图2。

表1 三组大鼠肺组织中细胞核因子κB（Nf-κB）、Nrf2表达变化/x ± s

2.3 ELISA 检测三组大鼠组织中Nf-κB、Nrf2 表达情况

胎粪组Nf-κB 表达水平高于胎粪+生理盐水组（

P

<0.05）、胎粪+生理盐水组显著高于生理盐水组（

P

<0.01）；胎粪组Nrf2 表达水平显著高于胎粪+生理盐水组（

P

<0.01）、胎粪+生理盐水组表达显著高于盐水组（

P

<0.01）。见表2。

表2 ELISA检测显示不同组别肺组织中细胞核因子κB（Nf-κB）、Nrf2表达情况/x ± s

3 讨论

胎粪样羊水在足月或过期产中经常出现，1%～3% 受影响婴儿可发展为胎粪吸入综合征。胎粪吸入综合征是增加新生儿死亡率的重要原因，具有较高的发病率，出现呼吸窘迫、顽固性低氧血症、肺顺应性下降及肺泡弥漫性渗出等表现，导致肺换气功能障碍的重症胎粪吸入综合征可诱发急性肺损伤，出现类ARDS 的病理过程。胎粪吸入主要是由胎儿窘迫或胎儿宫内吸入引起的，它能促使炎症、气道阻塞、肺发育中断和肺表面活性物质的缺乏。这种疾病的特点是呼吸窘迫及持续性肺动脉高压所致的气道阻塞和肺炎。

MAS 的形成机制尚不完全清楚。体外研究表明，由于炎症反应在肺泡中积聚的中性粒细胞和血浆蛋白是表面活性剂的潜在抑制剂，这也能够解释胎粪可以使表面活性物质失活的原因。有研究表明，胎粪可以刺激IL-8 的表达，抑制中性粒细胞的氧化爆发和吞噬作用，在胎粪样羊水中也可检测到高水平的IL-6。胎粪吸入也可能致上皮细胞凋亡。所有这些炎症反应是组成MAS 病理基础的一部分，胎粪吸入不仅引起新生儿的肺组织结构改变，如上呼吸道完全阻塞、肺不张、肺间质肺气肿或化学性肺炎，也继发一些生理性变化，如低氧血症、高碳酸血症、酸中毒、持续性肺动脉高压，甚至死亡。本研究HE 染色明确展示了大量中性粒细胞和脱落的上皮细胞在肺组织中积聚，并且部分胎粪组肺组织表面可见出血灶，这与上述结论一致。

本研究探讨了胎粪吸入致肺损伤中Nrf2 及NfκB的表达情况。随着胎粪吸入浓度的增加，信号通路Nf-κB 被激活，Nrf2 信号通路的表达也增强。由实验结果我们推论，胎粪吸入模型涉及氧化应激及炎症级联反应的各个方面。之前的研究表明，抑制炎性细胞因子的释放可以治疗ALI，通过抑制NF-κB 激活可减轻LPS 诱导的ALI。这与LPS 诱发的ALI 不同，主要涉及肺组织的炎症级联反应。Nrf2信号的激活也可调节氧化应激及抗炎基因的表达。之前的实验报道了青蒿琥酯可抑制多聚糖诱导的肺组织TLR4表达和Nf-κB 的激活，并在体内上调肺组织中Nrf2 和HO-1 的表达。在我们的研究中，随着胎粪吸入浓度的增加，2 种信号因子表达均有不同程度增强，考虑在胎粪吸入模型中涉及的免疫生理机制较复杂，且存在相互作用。因此在我们的胎粪诱导肺损伤模型中Nf-κB 的表达并不全依赖Nrf2 信号通路激活后对其的抑制作用。这与我们之前的推理不符。Nf-κB 是一种普遍存在的快速反应转录因子，广泛表达于多种细胞中，参与许炎症基因产物的产生。多种内源性和外源性刺激均可诱导Nf-κB 活化。在糖皮质激素（GCS）基因组调控机制中，GCS 与糖皮质激素受体（GR）相互作用，复合物激活后进入细胞核并与DNA 的特定核序列结合。当与反式作用元件作用时能抑制Nf-κB 和蛋白激活剂（AP）-1 转录因子，从而抑制炎性因子（IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等）、酶（PLA-2、COX-2、iNOS等）和其他生物活性物质（如PAF、ET-1 等）的表达。Nf-κB 已被证明在编码转录因子、黏附分子、细胞因子和生长因子的许多刺激基因的诱导表达中发挥了关键作用。这些物质在MAS 的发病机制中均起重要作用。因此，胎粪诱导巨噬细胞Nf-κB 活化可能是导致MAS 反应的关键机制。本研究实验发现，与生理盐水组、胎粪+生理盐水组比较胎粪组肺组织Nf-κB 含量升高，并且有更多的中性粒细胞浸润。说明胎粪有明显中性粒细胞趋化作用，我们有理由推测随着胎粪溶液的浓度增高，对肺组织炎症刺激更加明显，导致更多的Nf-κB 活化，而产生不同程度的肺损伤，包括炎症细胞浸润、肺组织间质增生、肺气肿等不良影响。

Nrf2是抗氧化基因激活的关键调控因子。病理条件下产生的活性氧（ROS）与蛋白质相互作用，通过多种途径损伤机体。目前，对Nrf2 的研究表明它是一个很有前景的ADRS 治疗靶点，许多研究表明Nrf2 活化在保护ALI/ARDS 中的重要性。Nrf2 是一种转录因子，调节参与抗氧化损伤保护的基因表达。Kelch 样ECH 相关蛋白（Keap）1 通过阻止Nrf2与抗氧化反应元件（ARE）结合而抑制Nrf2 的活性。Nrf2不仅仅具有细胞保护功能；它还调节与脂质、氨基酸、碳水化合物和核苷酸代谢相关的基因。最近的一项研究也强调了Nrf2 的致癌作用；持续的高核Nrf2 水平被证明可以增强合成代谢途径中基因的表达，从而促进癌细胞的增殖。有研究发现PI3K/AKT 抑制导致高氧诱导的肺泡Ⅱ型上皮细胞和巨噬细胞中的Nqo1（Nrf2 靶基因）表达水平降低。Nrf2 缺乏会导致细胞死亡，过表达可使细胞免受促凋亡及高氧应激的刺激，通过实验推测出PI3K/AKT 调节的细胞凋亡和随后的炎症途径通过Nrf2-ARE介导的抗氧化转录反应发挥作用。

MAS 的治疗要根据不同病情采取不同治疗策略，包括常规机械通气、高频通气、比例辅助通气、一氧化氮吸入、表面活性物质和体外膜肺治疗等。Kopincova 等在Nf-κB 选择性抑制剂IKKNBD 联合表面活性物质治疗胎粪诱导的急性肺损伤的研究中发现在所有的呼吸参数检测中都可见联合治疗后的快速效果和持续性效应。Li 等研究表明一种类黄酮药物可通过抑制体内外Nf-κB 的核移位，进而抑制TNF-α、IL-1β 等促炎性细胞因子的表达，对胎粪诱导的炎症反应有改善作用。也有实验证实大黄素对LPS 诱导的小鼠肺部炎症、肺水肿、MCP-1 和E-选择素的表达具有明显抑制作用，很可能是由于Nf-κB 信号通路的失活介导反应，表明大黄素对ALI 有治疗效果。高潮气量下的常规机械通气会导致肺泡过度扩张，导致呼吸机相关性肺损伤（Ventilator indused lung injury，VILI）、肺血管通透性增加和促炎递质释放。有研究证实Nrf2 在预防与VILI 相关的生物刺激反应方面的治疗作用。Nrf2通过调节氧化应激对机械通气诱导的急性损伤反应提供保护。在ALI的模型中Nrf2的激活被证明对肺损伤有保护作用。在肺部，包括环境氧化剂、药物和病原体在内的各种刺激物都能激活Nrf2。Nrf2抗氧化途径已被证明在各种肺损伤预防中起重要作用，包括支气管肺发育不良、慢性阻塞性肺疾病、特发性肺纤维化、哮喘和过敏等疾病，并被广泛用作新的治疗靶点。本研究旨在通过复制胎粪诱导ALI 模型，探讨Nf-κB、Nrf2 对胎粪诱导ALI 的作用及其机制，为临床应用提供理论依据。如选择能够使肺泡隔增厚减轻，并且减少炎性细胞的浸润的作用，通过负调控Nf-κB 的活性可保护肺组织并减少炎性因子的刺激的针对ALI 治疗性用药，对改善MAS 的预后有促进作用；Nrf2 通路的激活对胎粪诱导的ALI保护作用可为之后治疗性药物作用的潜在靶点。我们通过本研究可早期明确Nf-κB、Nrf2在胎粪诱导肺损伤中的作用机制，对减轻胎粪诱导肺损伤、预防新生儿持续肺动脉高压具有重要意义。