大补阴丸对链脲佐菌素诱导大鼠糖尿病模型的影响

胡斌，谢玲玲，李仁杰

糖尿病在中医文献记载中被称为消渴。是指以多饮、多食、多尿、身体消瘦为特征的病证。可出现继发性急性感染、肾及视网膜等微血管病变，严重时出现酮症酸中毒，甚至死亡。中医根据症状及病情发展阶段的不同，可将消渴可分为上、中、下三消。口渴引饮被称为上消，善饮易食被称为中消，饮一溲一被称为下消。消渴多因过食甘肥或情志失调，引起脏腑燥热、阴虚火旺所致。大补阴丸组成为熟地黄、知母、黄柏、龟板、猪脊髓，功效为滋阴降火。主治用于肾阴虚火旺证。现代常用于甲状腺功能亢进、糖尿病等属阴虚火旺证者。本研究自2018 年10 月至2019 年2 月研究大补阴丸对链脲佐菌素大鼠糖尿病模型的治疗作用。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF 级SD 大鼠85 只，雄性，体质量范围为180～220 g；购于广东省医学实验动物中心，动物许可证号：SYXK（粤）2014-136。本研究中对于大鼠的处理符合动物伦理学相关标准。

1.2 药物及试剂

大补阴丸，杭州胡庆余堂药业有限公司，规格60 克/瓶，批次1800370。盐酸二甲双胍片，中美上海施贵宝制药有限公司，规格0.85 克/片，批号H20023371，批次LT1103071EX。柠檬酸，国药集团化学试剂有限公司，批次20140108。柠檬酸三钠，天津市永大化学试剂有限公司，批次20151006。链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），美国sigma 公司，批次170735。水合氯醛，国药集团化学试剂有限公司，批次20120720。低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）测定试剂盒，三酰甘油（TG）测定试剂盒，总胆固醇（TCH）测试盒，高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）测定试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。葡萄糖，天津市永大化学试剂有限公司，批次20160801。

1.3 仪器

血糖仪abbott，freestyle lite 。Leica 切片机，德国（徕卡）生产。N4 型紫外可见分光光度计，上海分析仪器厂。YG-280型烤片机：阳光神琦医用科技有限公司。ZA120R4 型万分之一天平，上海赞维衡器有限公司。BX53 型奥林巴斯光电显微镜。YG-280KX 摊片机，湖北孝感市阳光神琦医用科技有限公司。

1.4 方法

1.4.1 STZ 溶液的配制

2.10 g 柠檬酸加入100 mL双蒸水配成A 液，2.94 g 柠檬酸三钠加入100 mL 双蒸水配成B液，将A、B液按1∶1.32比例混合，调定溶液pH 为4.0，即是配制STZ 的0.1 mol/L 柠檬酸钠缓冲液。将STZ 溶于0.1 mol/L 柠檬酸钠缓冲液中，配制成浓度为11 mg/mL 的STZ 溶液，现用现配，避光配制，低温保存。

1.4.2 分组、造模、给药

85 只雄性SPF 级SD 大鼠采用随机数字表法选取10只为空白对照组，其余大鼠造模后再进行分组。造模前大鼠禁食12 h，除空白对照组外其余大鼠腹腔注射浓度为11 mg/mL 的STZ（5 mL/kg）。注射STZ 的第7 天后，测随机血糖，选择随机血糖大于300 mg/dL 的大鼠纳入正式实验。根据血糖值将造模大鼠采用随机数字表法分为模型对照组、大补阴丸低剂量组（1.62 g/kg）、大补阴丸中剂量组（3.24 g/kg）、大补阴丸高剂量组（6.48 g/kg）、二甲双胍对照组（300 mg/kg），每组10只，剔除未成模及死亡的大鼠。各给药组灌胃体积为10 mL/kg，空白对照组及模型对照组灌胃等体积的蒸馏水。给药12 周，末次给药前一天测随机血糖，末次给药1 h 后测空腹血糖及血糖曲线下面积，实验结束时大鼠用10% 水合氯醛麻醉，腹主动脉取血，用于血脂的检测，最后取肾脏和肝脏福尔马林固定，用于HE染色。

糖耐量试验：实验时先取禁食动物血糖（为零时），然后给药，1 h 后灌胃绵白糖（2.5 g/kg 测定给糖后0、0.5、1 及2h的血糖值以计算血糖曲线下面积）。

2 结果

2.1 大补阴丸对糖尿病模型血糖的影响

与空白对照组相比，模型对照组初始随机血糖、治疗后随机血糖均显著升高（

t

=12.768、12.273，

P

<0.05）。与模型对照组相比，各治疗组初始随机血糖差异无统计学意义（

P>

0.05）。与模型对照组相比，大补阴丸高剂量组、二甲双胍对照组治疗后随机血糖显著降低（

t

=4.072、3.116，

P

<0.05）。大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组、二甲双胍对照组治疗后随机血糖下降率大于20%。见表1。

表1 各组初始随机血糖、治疗后随机血糖及血糖下降率比较

与空白对照组相比，模型对照组血糖曲线下面积显著增加（

t

=10.032，

P

<0.05）。与模型对照组相比，大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组和二甲双胍对照组血糖曲线下面积显著降低（

t

=3.180、4.008、5.869，

P

<0.05）。见表2。

表2 大补阴丸对糖尿病模型大鼠血糖曲线下面积的影响/± s

2.2 大补阴丸对糖尿病模型血脂的影响

与空白对照组相比，模型对照组总胆固醇和总三酰甘油显著增加（

t

=6.003、6.272，

P

<0.05）。与模型对照组相比，大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组和二甲双胍对照组血清总胆固醇、总三酰甘油均显著降低（

t

=2.965、4.339、4.845，

t

=3.020、4.413、4.646，

P

<0.05）。见表3。

表3 大补阴丸对糖尿病模型大鼠总胆固醇和总三酰甘油的影响

与空白对照组相比，模型对照组低密度脂蛋白显著增加（

t

=9.529，

P

<0.05），高密度脂蛋白显著降低（

t

=4.255，

P

<0.05）。与模型对照组相比，大补阴丸低剂量组、大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组和二甲双胍对照组血清低密度脂蛋白显著降低（

t

=2.723、4.765、5.786、6.126，

P

<0.05）。与模型对照组相比大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组和二甲双胍对照组高密度脂蛋白显著增加（t=2.946、2.619、2.291，

P

<0.05）。见表4。

表4 大补阴丸对糖尿病模型大鼠低密度脂蛋白和高密度脂蛋白的影响/± s

2.3 大补阴丸对糖尿病模型大鼠肾脏组织形态学的影响

通过HE 染色结果显示，正常对照组大鼠的肾组织中肾小球细胞清晰，形态规则，肾小管排列整齐。与正常对照组相比模型对照组大鼠的肾组织有明显病变，肾间质发生炎症细胞浸润，基膜和系膜细胞增生、肾小球肥大，肾小管排列紊乱。与模型组相比大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组和二甲双胍对照组的肾组织病变明显减轻，肾间质尚有散在的炎症细胞浸润，基膜和系膜细胞增生较轻，肾小管排列整齐，且大补阴丸对肾组织的影响呈现良好的剂量依赖性，见图1。

2.4 大补阴丸对糖尿病模型大鼠肝脏组织形态学的影响

正常对照组大鼠肝脏结构完整，细胞核居于细胞中心，肝小叶结构正常。模型组大鼠肝小叶界限模糊，其细胞索散乱分布，肝细胞有脂肪浸润，肝细胞水肿变性，炎症细胞聚集。与模型组相比大补阴丸中剂量组、大补阴丸高剂量组和二甲双胍对照组不同程度上改善大鼠肝细胞损伤，细胞排列较规则，无过多的脂肪浸润，肝细胞水肿变性有所减轻，炎症细胞聚集明显减少，见图2。

3 讨论

糖尿病是以高血糖为特征的代谢性疾病，因胰岛素分泌缺陷或胰岛素生物作用受损，长期存在的高血糖，导致肾、心血管、神经等组织的慢性损害。糖尿病患者常出现血脂代谢异常，如TCH、TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C 水平降低。糖尿病的病因至今尚未完全明确，公认糖尿病是复合病因引起的综合征。糖尿病发病与遗传、自身免疫及环境等因素有关。从胰岛的β细胞合成和分泌胰岛素通过血循环到达体内各组织器官的靶细胞，与特异性受体结合，引发细胞内物质代谢效应，在整个过程中任何一个环节发生异常均引起致糖尿病。糖尿病的代谢紊乱主要是由于胰岛素生物活性绝对或相对不足引起的，临床主要表现为易饥、多食、口渴、多饮、多尿及体质量减轻。链脲佐菌素可选择性损伤胰腺β-细胞，进入胰岛的β-细胞，烷化DNA，造成细胞死亡，最终胰岛素分泌不足导致高血糖。给药组动物的血糖值明显低于对照组动物的血糖值，血糖下降率≥20%，经统计学处理，给药组与对照组的血糖值差异有统计学意义（

P<0.05

），则可认为该药有降血糖作用。本研究结果显示与模型对照组相比大补阴丸高剂量组治疗后随机血糖显著降低。与模型对照组相比大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组血糖曲线下面积显著降低。大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组治疗后随机血糖下降率大于20%。因此可以得出大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组具有一定的降血糖作用。

目前威胁糖尿病病人生命最严重的并发症为心血管病变，血管病变非常广泛，大中小血管、动脉、毛细血管和静脉均可累及，许多脏器发生病变，特别是心血管等大血管病变、眼底、肾脏等的微血管病变。因糖尿病患者常出现血脂代谢异常，如TCH、TG 和LDL-C 水平升高，HDL-C 水平降低，因此易发生动脉粥样硬化。动脉粥样硬化见于半数以上病人，常引起心、脑、肾严重并发症而致死。本研究结果显示与模型对照组相比大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组血清总胆固醇显著降低。与模型对照组相比大补阴丸高剂量组血清总三酰甘油显著降低。与模型对照组相比大补阴丸低剂量组、大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组血清低密度脂蛋白显著降低。说明大补阴丸可调节糖尿病模型大鼠脂代谢，减少动脉粥样硬化发生的致病因素的作用。

光镜下发现糖尿病患者微血管病变的特征为毛细血管基膜增厚，基膜中有糖类沉积，微血管病变伴有微循环异常，最为明确的是肾小球基膜，也见于肾小球系膜中。在伴有微量蛋白尿的糖尿病患者中，肾小球硬化症中的肾小球基膜内带负电荷的硫酸类肝素蛋白多糖含量明显降低。细胞外基质或肾小球基膜中硫酸类肝素蛋白多醣的降低导致肾小球基膜的负电荷降低，白蛋白易于自肾小球基膜漏出，动脉也易于发生硬化。糖尿病肾小球硬化可分结节型、弥漫型及渗出型3 种。结节型毛细血管糖尿病肾小球硬化症，肾小球毛细血管周围有球形结节，内含PAS 阳性糖蛋白、脂质及血红蛋白，形成网状分层结构病变。弥漫型糖尿病性肾小球硬化，毛细血管壁增厚，由于基膜增厚，影响通透性和电荷改变，故常有微量白蛋白尿。渗出型糖尿病性肾小球硬化，肾小球囊腔中有透明而深伊红色纤维蛋白样物质沉积，内含三酰甘油、胆固醇及粘多糖。死于糖尿病昏迷者可发生急性肾功能衰竭伴肾小管坏死。典型糖尿病肾脏病变电镜下示肾小球基膜增厚及基质增多扩大为特征，与糖代谢紊乱有密切关系。在糖尿病患者中肝部肿大，脂肪浸润、水肿变性及糖原减少，脂肪肝很常见。本研究结果显示大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组的肾组织病变明显减轻，肾间质尚有散在的炎症细胞浸润，基膜和系膜细胞增生较轻，肾小管排列整齐。大补阴丸中剂量组和大补阴丸高剂量组不同程度上改善大鼠肝细胞损伤，细胞排列较规则，无过多的脂肪浸润，肝细胞水肿变性有所减轻，炎症细胞聚集明显减少。

综上所述，本研究结果表明大补阴丸可通过降低血糖及血脂水平对大鼠糖尿病模型产生保护作用。