检测牛奶中杂质的表面增强拉曼光谱基底研究进展

陈 霜，李 丹，于海燕，陈 臣，陈 彬，田怀香

（上海应用技术大学香料香精技术与工程学院，上海 201418）

发展中国家的人们生活水平的提高以及他们对健康的追求导致了全球牛奶消费量的快速增长，与此同时，牛奶的质量和安全也越来越受到消费者和生产者的关注。在生鲜乳诸多安全质量问题中，掺假对消费者的身心健康有巨大伤害，对行业发展的影响最为恶劣。总地来说生鲜乳中常见的掺假物质包括三聚氰胺、尿素和双氰胺等，这些物质常被用来人为地提高牛奶加水稀释后的含氮量；甲醛、过氧化氢、苯甲酸、重铬酸和水杨酸等物质被用来延长产品的保质期[1−3]。此外，牛奶中化学残留物质还包括磺基吡啶、四环素、青霉素G 以及福美双和双酚A[4−7]等。

在过去的十年里，已经提出了多种分析方法，用于快速筛查或选择性地确定牛奶的质量。液相色谱、气相色谱与质谱联用用于高选择性的测定[8]，近红外、中红外、紫外-可见光谱和同步荧光光谱法在内的光谱技术也已被用于检测牛奶的质量，这些方法所涉及的样品前处理较复杂、成本高、耗时长，无法满足现场样品高通量的快速筛查要求[8−9]。

Fleischmann、Van Duyne 和Creighton 三个研究组在十九世纪七十年代中后期率先发现吡啶分子吸附在粗糙的银电极表面时，可以使拉曼散射光谱的强度得到很大地增强，他们确认了粗糙金属表面上出现的拉曼信号明显增强的现象，并不是因为增加了吸附分子的量而引起增强的，而是由于拉曼散射效率本身的极大提高，现在称之为表面增强拉曼光谱(Surface Enhanced Raman Spectroscopy)效应，简称SERS[10−12]。SERS 技术在检测过程中只需将制备好的基底材料与待测样品混合进行拉曼信号采集，因其不需要长时间的样品预处理、可实现快速痕量无损检测、不受样品中水的干扰以及设备便携等优点而成为一种新型的快速检测技术[13]。在web of science中以“SERS”和“milk”为关键词检索，2010～2019 年SERS 技术应用于牛奶检测的出版物数量呈快速增长趋势（如图1 所示），这表明了SERS 技术在全球乳制品检测中的重要性。因此，本文对纳米SERS 基底进行了全面的综述，为SERS 技术在牛奶快速检测领域的研究提供参考。

图1 近十年SERS 应用于牛奶检测的出版物数量Fig.1 Number of publications on SERS detection of milk in the past decades

1 抗菌剂残留的检测基底

粘菌素和青霉素是两种高效抗菌剂，被广泛用于预防和治疗奶牛乳房炎，这些抗生素会少量残留于患病奶牛所生产的牛奶中，并通过食物链进入人体，可导致严重的过敏反应和细菌耐药性。因此，监控牛奶中残留的抗生素，对保障食品安全具有重要意义。SERS 技术能否高效地检测出低含量的抗菌剂残留，关键是制备出优异的SERS 活性基底，既要有很高的灵敏度，又要有良好的稳定性和重复性。

闫磊等[14]建立了一种检测牛奶中的粘菌素的竞争性免疫分析系统，该系统由5,5-二硫双-2-硝基苯甲酸(DTNB)标记的AuNPs 与抗粘菌素单克隆抗体(mAb)结合成SERS 探针，当样本中粘菌素浓度越高时，越少的捕获抗原会与SERS 纳米探针结合，SERS 信号从而降低。该体系的检出限为0.10 μg/mL，回收率为88.1%～112.7%。因此，这种基于SERS的竞争性免疫传感系统在牛奶中粘菌素的快速监测中具有广阔的应用前景。

Chen 等[15]实现了以Ag NPs 为基底材料，对实际牛奶样品中的青霉素G 残留的检测，检出限为2.54×10−9mol/L(相当于0.85 μg/kg)，低于欧盟标准规定可检出的最大浓度(4 μg/kg)。该方法有望在食品安全领域为动物源食品中β-内酰胺类抗生素残留的检测提供参考。李海闽等[16]以银溶胶为SERS 活性基底，建立了牛奶中阿莫西林含量的SERS 检测方法。在最佳检测条件下，阿莫西林标准溶液的浓度与1055 cm−1处拉曼特征峰的SERS 信号强度在1～1000 μg/mL 范围内有良好的线性关系，方法的检出限可达到1 μg/mL，回收率为84.51%～93.62%，相对标准偏差（RSD）为5.16%。

Moreno 等[17]用多壁碳纳米管(MWCNTs)包裹金纳米粒子(AuNPs)制备了MWCNTs-AuNPs 基底，实现了牛奶样品中磺基吡啶的定性和定量，LOQ为8.8 ng/ mL，增强因子为4394 倍。提出的基底制备简单、可重复使用，样品不需要任何预浓缩步骤，只需一台便携式拉曼光谱仪即可，但这种基底不能广泛用于其他物质的检测而有一定的局限性。Li 等[18]报道了一种以磁铁矿胶体纳米晶簇-聚甲基丙烯酸(MCNCs-PMAA)的磁性纳米球(MNs)与适配体结合作为捕捉探针，以Au/PATP/SiO2(APS)与核酸适配体cDNA 结合为信号探针的SERS 传感器，实现了牛奶中四环素的快速检测。该适配传感器具有良好的检测性能，LOD 为0.001 ng/mL，灵敏度高，对一般共存干扰具有良好的选择性（表1）。

表1 检测牛奶中残留化学物质的SERS 基底Table 1 SERS substrates for detection of residual chemicals in milk

纸质SERS 基底的制备为拉曼光谱在食品安全领域的快速检测提供了新的解决方案，纸质增强基底拉曼光谱法可成功实现牛奶中的抗生素、微生物的检测。Marques 等[19]采用一步热蒸发在纸基材料上镀一层AgNPs 做SERS 增强基底，检测时将两微升掺有四环素的牛奶滴在这个纳米等离子体平台上并干燥，检测限低至0.1 ppm。研究表明，这种纸基平台非常稳定，保质期可达几个月，可一步定性和定量牛奶中的四环素，而不需要任何样品的预处理，是潜在的现场监测四环素和其他抗生素残留的有效工具。

上海师范大学资源化学教育部重点实验室[20]采用两步法制备了可重复的三维ZnO/Ag@Au 衬底（如图2 所示），建立了一种灵敏度高的检测抗生素的方法。靶样品与ZnO/Ag@Au 复合材料巨大的表面积之间的强相互作用促进电荷转移，从而产生了良好的化学增强效应，该方法用于牛奶中抗生素磺基吡啶的测定，检出限可达1×10−9mol/L。

图2 三维复合材料ZnO/Ag@Au 制备原理及其在牛奶中磺基吡啶的测定Fig.2 Schematic diagram for the fabrication of 3D hornlike ZnO/Ag@Au composite materials and their SERS application of determination of sulfapyridine in milk

2 三聚氰胺的检测基底

三聚氰胺是一种价格低廉、含氮量高的水溶性化合物，在化学工业中广泛用于合成三聚氰胺树脂。然而，三聚氰胺有时被非法添加到乳制品中冒充蛋白质含量。虽然三聚氰胺本身毒性很低，但摄入超过安全限量的三聚氰胺会导致急性肾功能衰竭、膀胱癌，甚至死亡。

2.1 金属溶胶基底

金属溶胶基底是一种制备简单、增强效果明显且应用比较广泛的SERS 基底。冯彦婷等[21]以金属钛板作为SERS 衬底材料，采用50 nm 银纳米颗粒作为基底，通过便携式拉曼光谱仪采集样品的SERS信号。在质量浓度0.2～10 mg/L的范围内，SERS 强度随着牛奶中三聚氰胺浓度的增大而增强，线性相关系数R2=0.998，检测限为0.08 mg/L。Kaleem 等[22]报道了用纳米金球包埋整体偶联物（GNS@GEMS）快速检测牛奶中微量三聚氰胺的方法（如图3 所示），检测限为0.11 mg/L，定量限为0.38 mg/L，检测三聚氰胺的时间为10 min。Xu 等[23]利用银离子导体RbAg4I5薄膜，在外加电流强度分别为1 μA 和7 μA的条件下，采用真空热蒸发法制备了高表面粗糙度银纳米片作为SERS 底物，将其用于液态奶中三聚氰胺的检测。在任何情况下只需醋酸预处理即可检测出液态奶中三聚氰胺，最低检测浓度为10−9mol/L。

图3 纳米金球包埋整体偶联物（GNS@GEMS）的制备图Fig.3 Preparation of nano-gold spheres embedded integral conjugate (GNS@GEMS)

2.2 三维基底

三维SERS 衬底具有良好的SERS 性能，是当前 SERS 基底研究的热点和难点。三维结构具有特殊光学性质和大的比表面积。特殊的三维网状结构有利于分子吸附，此外还促进了有效光散射的次数。在肖海波等[24]的研究中，利用包覆Au NPs的纳米纤维素（NFC）实现了三维柔性SERS 基底的简易合成。将合成的SERS 底物用于液态奶中三聚氰胺的检测，能够定量测定牛奶中的三聚氰胺，并获得了满意的检测限（1 ppm）和回收率，检测过程可在15 min内完成。NFC/AuNP 底物具有较好的均匀性，可以用于食品安全的SERS 分析，但仍需要进一步研究不同类型的材料性能，提高基底和SERS 方法的灵敏度。Li 等[25]采用一种简单、低成本的方法制备了三维AgNPs@MoS2/聚甲基丙烯酸甲酯锥形等离子体结构SERS 基底。该衬底的EF 达到了5.89×109，检出限为10−6mol/L。Zhao 等[26]也制备了一种MoS2/AuNPs-AgNPs/PMMA 三维锥体基底（如图4 所示），用于检测液态奶中的三聚氰胺分子，检出限可达10−9mol/L。他们制备的底物具有良好的痕量分子检测能力，为进一步的应用奠定了基础，显示了其在原位检测方面的巨大潜力。

图4 合成MoS2/AuNPs-AgNPs/P-PMMA SERS 衬底的工艺示意图Fig.4 Schematic illustration of the process for the synthesis of flexible MoS2/AuNPs-AgNPs/P-PMMA SERS substrates

李俊梅等[27]研究了在MoS2膜上原位合成AuNPs-AgNPs 纳米颗粒，制备了一种基于异质交叉分布的金属结构与MoS2杂化的三维金字塔SERS活性衬底。用AuNPs-AgNPs/MoS2/P-Si 杂化SERS衬底检测液态奶中三聚氰胺的LOD 值为10−11mol/L，该衬底具有良好的均匀性和重现性，展现了最佳的表面增强拉曼散射性能。研究结果证实，基于双金属核壳纳米颗粒的SERS 衬底具有快速、同时检测牛奶等复杂食品基质中其他有害化学物质残留的潜力。

除了金属的SERS 增强效应明显外，半导体材料在增强SERS 信号方面也很有应用价值[28−30]。Lu 等[31]以不锈钢纤维为固相载体，用水热法在其表面合成ZnO 纳米棒，再通过离子溅射将 Au NPs 修饰到ZnO 纳米棒上，形成 Au-ZnO 纳米棒复合基底，增强因子为5.3×105。西安交通大学的Huang 等[32]报道了一种独特的基于AgNPs 修饰的ZnO/Si 异质结构纳米阵列的SERS 检测三维纳米结构。将所制备的底物用于罗丹明6G(R6G)的检测，检测下限为10−16mol/L，增强因子高达8.7×107，三聚氰胺的检测限低于10−9mol/L。在Wang 等[33]的研究中，采用多步连续沉积法将夹有3 nm SiO2层的三维的AuNPs 组装到TiO2Ns 上，由于形成了超细等离子体带隙和半导体/金属界面，从而形成了大量的热点，三聚氰胺的检出限为0.9 mg/L（表2）。

表2 检测牛奶中三聚氰胺的SERS 基底Table 2 Conventional SERS substrates for detection of melamine in milk

这些研究表明基于半导体材料ZnO、Si、TiO2和重金属的三维纳米基底SERS 方法的灵敏度高、检测能力强，在食品安全和生物医学分析中具有广阔的应用前景。

2.3 柔性基底

近年来，由于大多数SERS 基底制备工艺非常复杂，基片本身缺乏灵活性、生态友好性和经济性[38−39]，使SERS的发展受到了限制。因此，开发可以克服上述缺点的新型SERS 基底在食品安全和环境应用中的分析检测已经十分必要[40−41]。

SERS 基底的性能取决于SERS 活性衬底的材料和纳米结构的选择，与硅片和金属膜等光滑的表面载体相比，纸张中的天然褶皱和纤维结构有利于金属纳米颗粒的均匀分布和SERS 热点的形成[42−43]。最近，基于纤维素的纸质衬底因其独特的一系列优点(例如，100%可回收、柔性和低成本)而被开发用于多种光谱检测。纸质增强基底可应用于牛奶基质中痕量三聚氰胺的分析，Mekonnen 等[44]将Ag@SiO2纳米立方体负载到小型化滤纸上，建立了一种简单、廉价、灵敏的纸杂化等离子体SERS 基底，检测限0.17 mg/L。与刚性衬底相比，这种改进的颗粒间距和均匀性使得SERS 活性更高、更可靠，并且能够以较低的成本和较短的时间检测牛奶中的三聚氰胺。

滤纸的亲水性促进了金属纳米材料的均匀分布，同时也可能使样品溶液容易吸收到纸中并随机扩散到大片区域[41,45]，导致纸基基底的SERS 信号变弱，灵敏度和重现性变差。于是，研究者们受自然界中的荷叶的启发，开发出了超疏水表面基底[46−47]，并将其成功地应用于SERS 技术中。Wu 等[48]以涂蜡的硅片作为疏水表面，使水相中AuNPs 与目标分析物的混合体（AuNPs-Analyte）聚集和浓缩。干燥后，在基底上的AuNPs-Analyte 层上滴铸另一层AuNPs，从而引入更多的热点进一步增强拉曼信号，形成AuNPs-Analyte/AuNPs 双层结构。该传感器对牛奶中三聚氰胺的检测表现出较高的重现性、灵敏度和回收率，检测限在亚纳摩尔浓度水平，说明该SERS传感平台在食品安全检测具有良好的应用前景。Han 等[49]先用十六烯基丁二酸酐对纤维素纸进行改性，以生成能够浓缩三聚氰胺(和其他疏水分析物)的疏水顶层，从而防止含水的样品在纸张上扩散。随后将AgNPs 载入到疏水纸张上，以形成大规模的SERS 传感阵列。将该阵列应用于牛奶中三聚氰胺的检测，检出限为0.27 mg/L。Zhang 等[50]采用类似的方法，使AgNPs 吸附在NaCl 处理过的普通实验室滤纸上，再用疏水剂处理纸基表面，制备了一种接触角接近150°的疏水性纸基SERS 基底（如图5 所示）。首次实现了直接液滴SERS 检测牛奶中的三聚氰胺，检测限可达0.65 ppm。这两种方法制备的基底都综合了易于生产、重现性好和灵敏度高的优点，是理想的表面增强拉曼光谱检测基底。

图5 疏水性纸基SERS 平台制作与分析过程示意图Fig.5 Schematic illustration of the fabrication and analysis process for hydrophobic paper-based SERS platform

目前SERS 衬底的制备方法(如电化学粗糙电极、基于光刻的微细加工衬底、胶体自组装等)往往复杂且耗时。印刷、喷雾等方法是实现大规模有序功能图案或阵列的高通量、简便性和高性价比的有力候选者。这是一种根据需要将制备好的等离子体纳米墨水（如银纳米球、金纳米球、金纳米棒等）通过打印机、钢笔、画刷、喷雾瓶等手段将墨水喷在纸上或柔性衬底上的方法。Wu 等[51]通过在塑料PET(聚对苯二甲酸乙二醇酯)基板上丝网印刷AgNPs 制备了低成本、高灵敏度性和可重复的SERS 基板。利用印刷后的银基底作为SERS 平台，无需预处理，即可在鲜奶中检测出三聚氰胺，这将加速牛奶掺假快速在线检测的应用。他们的丝网印刷方法突出了大规模印刷的优势，用于制造功能明确的纳米结构，其应用远远超出SERS 传感领域。Creedon 等[52]报道了一种透明SERS 衬底的制备，该衬底是用铝片和玻璃载体做模板，在热塑性聚偏氟乙烯聚合物表面制备纳米结构，得到柔性透明的聚合物基体，然后在其上沉积一层银（30 nm）。该传感器具有快速、定量和高灵敏度的特点，例如采用滴干法检测牛奶中三聚氰胺，总分析时间小于10 min，实验测得检出限为0.1 ppm。作者还将此方法与质谱进行了对比实验，结果表明，其检测限接近质谱方法的检测限，而又不用复杂的预处理过程，因此这些底物提供了现场快速检测样品的可能性。柔性基底快速检测牛奶中三聚氰胺的应用见（表3）。

表3 检测牛奶中三聚氰胺的柔性SERS 基底Table 3 Novel flexible SERS substrates for detection of melamine in milk

然而，由于这些柔性SERS 基底的标准还没有被系统的研究和报道，要实现大规模生产仍然是困难和复杂的。只有基底的标准、重复性被很好的确认，这些平台才能从实验室发展到真正的产品。

3 其他物质的检测基底

双金属核壳纳米颗粒(Au@AgNPs)是最近提出的拉曼增强基底之一，因为它们同时具有AuNPs 和AgNPs的增强效果，并且制备简单、稳定性高和光学性能优异。Hussain 等[55]用120 μL 半胱胺盐酸盐(0.1 nM)成功地接枝了直径为28 nm的金核、壳厚为5 nm的银壳，制备了一种半胱胺功能化核壳纳米颗粒(Au@Ag-CysNPs)。用所建立的方法检测液态奶样品中的硫氰酸钠和苯甲酸防腐剂残留，LOD 为0.03 mg/L 和 9.8 mg/L，LOQ 为 0.039 mg/L 和10.2 mg/L。作者在另一项研究中还制备了金核直径为28 nm，银壳厚度为8 nm的 Au@AgNPs 纳米颗粒，同时快速检测标准溶液和液态奶样品中的福美双（杀虫剂）和双氰胺，LOD 分别为0.21 ppm 和14.88 ppm，LOQ 分别为0.24 ppm 和15.1 ppm。调节pH，然后离心是这两项研究中唯一的样品预处理步骤[28]。宋移欢等[56]以纳米胶体金为SERS 基底建立牛乳中乐果、西维因、甲拌磷、倍硫磷4 种农药残留的快速检测方法，单个样品在5 min 内即可完成检测，4 种农药在0.1～10 μg/m L的质量浓度范围内，与相应的特征峰强度呈良好的线性关系，样品加标平均回收率为72.7%～108.1%，相对标准偏差为1.0%～13.3%。方法简便快速、准确度好、结果可靠,适用于牛乳样品中农药残留的初步筛查和鉴定。

Ilhan 等[57]建立了一种基于SERS的大肠杆菌快速检测和鉴定方法，即纸基侧向流动免疫分析（LFIA）系统，实现了从牛奶样品中磁富集细菌与快速SERS 检测的结合，LOD=0.52 cfu/mL，LOQ=1.57 cfu/mL。建立的方法可用于大肠杆菌的快速、可靠、灵敏和选择性的检测，总分析时间小于60 min，由于其在临床诊断、食品工业或法医学中的应用潜力，引起了广泛关注。

4 结语

SERS 技术作为一种新兴的快速检测方法，因可以提供物质的指纹图谱和操作简单、对样品检测无损且不受水干扰、高灵敏度等优点，在牛奶中杂质的检测中有着巨大的应用潜力。所报道的SERS 基底在牛奶检测的应用中，所检测的物质以三聚氰胺、抗生素、农药为主，而甲醛、过氧化氢、重铬酸和水杨酸等掺假物质还未见报道，但这些物质如果被添加到牛奶中也会对牛奶消费者的健康带来威胁，因此应当将SERS 技术的研究更加广泛的引入牛奶中其他类型掺假物和有害物质的检测中。

从现有的文献报道可知SERS 技术的研究现状为：SERS 基底的重现性和稳定性比较差，利用SERS 技术进行食品现场快速检测的推广较难大范围进行，目前研究比较多的SERS 基底材料是贵金属或贵金属和其它材料的复合物，这些材料成本较高，导致贵金属基底的应用受到一些局限；柔性纸基和疏水性SERS 基底是表面增强拉曼光谱研究的一个新热点，但这种基底的研究还处于实验室阶段，并且较常规基底所实现的检测限来说新型基底的检测限高，因此新型基底需要突破检测不灵敏度、难以实际应用的问题。综上所述，牛奶检测的SERS 基底的研究趋势主要有三个方面：首先是对SERS 基底材料成本较高问题，可开发更多的磁性、半导体材料的增强基底，将新型材料制备的基底推广到更多物质的快速检测中；其次是针对SERS 基底稳定性差的问题，可开发一种具有稳定基质（如聚合物、介孔二氧化硅、过渡金属材料）的材料以保护纳米颗粒的活性，提高基底的稳定性；最后，对于纸基和疏水性SERS 基底灵敏度低的问题，研究者们可将纸基SERS 基底中所用到的材料纸进行改性或用高分子材料代替；相信随着科学技术的发展，SERS 技术一定能实现高效、便捷、灵敏地检测待测样品。