鱼肉内源性蛋白酶对其贮藏期品质影响的研究进展

王慧平，张 欢，陈 倩，孔保华

（东北农业大学食品学院，黑龙江哈尔滨 150030）

鱼肉因味道鲜美且富含优质蛋白而备受消费者青睐。我国是重要的水产品生产国，其产量占世界总产量的40%。《2020 中国渔业统计年鉴》年度数据显示，2019 年全国水产养殖产量高达5079.1 万吨，其中鱼类产量2708.6 万吨，占全年水产养殖总产量的53.3%，是水产品的重要组成部分[1]。随着国民经济水平的不断提高，市场鱼肉产品的消费需求不断攀升，高品质、高营养价值的鱼肉成为人们关注的焦点。

新鲜的鱼肉即使低温贮藏也极易变质，品质的降低直接影响鱼肉产品的市场销售。除贮藏温度、贮藏时间和鱼种类等因素外，鱼肉本身含有的内源性蛋白酶对鱼肉贮藏期品质的影响近年来逐渐引起公众的关注。鱼类死后肉质通常经过四个变化阶段：僵直、解僵、自溶和腐败，其中自溶过程就是由于自身肌肉中内源性酶引起的[2]。在鱼类肌肉中，蛋白质含量约占15%～20%，是其主要组成成分。贮藏过程中品质的改变与肌肉中结构蛋白的降解有着密切的关系，这种改变初期通常受其内源性蛋白酶的影响，分解产生的代谢产物促进微生物的生长繁殖，加速鱼肉变质[3−4]。鱼肉的贮藏温度通常为−18 ℃，但有研究表明，蛋白水解酶即使在−20 ℃条件下仍有活性[5]。鱼肉品质与结构蛋白高度相关[6]，因此，探究鱼肉贮藏初期内源性蛋白酶在鱼肉中的作用机理，并做出针对性的调控是保障鱼肉品质的一种重要途径。

随着科研人员对酶领域的不断探索，鱼肉的内源性蛋白酶作用理论逐渐成熟，解决保质期内贮藏鱼肉质量劣变问题的研究已取得一定成果。本文主要介绍了几种内源性蛋白酶在贮藏过程中对鱼肉品质造成的影响，简要阐述当前使用的内源酶活性抑制技术，并对鱼肉品质控制的研究做出展望。

1 内源性蛋白酶

内源性蛋白酶是鱼体自身存在的蛋白酶，可以水解蛋白质肽键，改变蛋白质构象或结构，致使蛋白质的物理化学性质及功能性质改变。活鱼中的内源性蛋白酶能够对其生理或病理性问题进行调控，以维持稳态；但鱼死后内源酶的激活和释放会造成相应结构蛋白等底物的变性水解，破坏鱼肉品质[7]。研究表明，对这一过程影响最大的蛋白酶为基质金属蛋白酶、钙蛋白酶和组织蛋白酶[8−9]。

1.1 基质金属蛋白酶

基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）属Matrixin 家族，包括胶原酶和明胶酶等，需结合Zn2+和Ca2+才具活性，在生理或病理条件下，这些酶能够发挥组织重塑、伤口愈合和血管生成等作用，参与调控细胞外基质代谢过程[7,10]。正因如此，基于MMPs的研究多集中在与人类疾病健康相关的医学领域，鱼肉贮藏中的探究相对较少。

至今已在脊椎动物中鉴定出26 种MMPs，其中由MMP-2 和MMP-9 基因编码的蛋白酶对结缔组织的解体尤其是胶原蛋白的降解作用效果显著[11−12]。MMP-2 蛋白酶存在于骨骼肌和心肌细胞中，其活性从死后第2～13 d 显著提高，心肌细胞中的α-肌动蛋白、结蛋白、肌球蛋白轻链和肌钙蛋白均可作为MMP-2 蛋白酶的底物，因此推断MMP-2 基因可能在肌肉结构蛋白的调控过程中发挥重要作用[13−14]。早在1995 年Bracho 等[15]就从太平洋石斑鱼中提取出胶原酶和明胶酶，并表示其可能与鱼肉贮藏期间胶原蛋白的降解有关。硬骨鱼肌肉中的胶原主要有I 型胶原和V 型胶原两种，二者具有不同的生化特性[16]。同样，徐超[17]也从蓝圆鰺肌肉中分离出I 型胶原和V 型胶原，并证明了MMPs 能够将其水解。王诚[18]在Bracho 等[15]研究的基础上提纯了鲤鱼体内的MMPs，发现在4 ℃贮藏过程中，该酶活力显著提高，同时肉的硬度、聚集性、弹性、粘结性及咀嚼性等参数较新鲜鱼肉均发生了显著的下降，推测MMPs 活力与鱼肉质地参数的变化密切相关。

1.2 钙蛋白酶

钙蛋白酶（Calpains）为中性半胱氨酸蛋白酶，包括m-calpains 和μ-calpains 两类，具有钙依赖性，二者对Ca2+敏感度不同，在细胞的生理pH 下活跃，均由Ca2+激活而表现活性[19−20]。该酶是由大小两个亚基组成的异二聚体，大亚基分子量为80 kDa，小亚基分子量为28 kDa[21]。亚基结构如图1 所示。

图1 钙蛋白酶亚基结构图[22]Fig.1 Structure diagram of calpain subunit[22]

C-蛋白、结蛋白、肌联蛋白、伴肌动蛋白、肌间线蛋白、肌钙蛋白等均能够作为钙蛋白酶的底物[22]。鱼死后随着肌球蛋白的变性，Ca2+的调节能力丧失，胞内Ca2+浓度升高，钙蛋白酶表现出活跃状态[23]。被激活的钙蛋白酶作用于骨骼肌肌节连接处的Z 线。Z 线的组成成分之一是能固定肌动蛋白的α-肌动蛋白，它的完整性对单个肌节中蛋白粗丝与细丝的相互作用至关重要，其损坏会导致肌原纤维分解断裂[24−25]。Shigemura 等[26]也表示，在鱼贮藏24 h时肌原纤维就开始遭到破坏。但在24 h 内整体蛋白水解水平很低[27]，这表明钙蛋白酶可能在蛋白降解初期发挥重要作用，但不足以导致鱼肉品质劣变。当鱼宰后7 d pH 低于6 时，钙蛋白酶仍然活跃，期间它对蛋白质的降解活性保持在相对稳定的状态，从而对肌原纤维蛋白造成缓慢的破坏[16]。

1.3 组织蛋白酶

组织蛋白酶（Cathepsin）存在于溶酶体中，无法与底物接触，因此它们在活鱼体内通常为无活性状态；而鱼死后的贮藏过程中，随着冰晶生长、升华，溶酶体破坏，使得组织蛋白酶释放，对肌细胞中的蛋白质产生作用[28]（如图2）。溶酶体中至少有15 种组织蛋白酶，其中组织蛋白酶B、D、L、H 是鱼死后体内高度活跃的组织蛋白酶，它们可以水解肌肉蛋白中含量最高的肌原纤维蛋白[16,30]。

图2 组织蛋白酶释放及作用示意图[29]Fig.2 Schematic diagram of cathepsin release and action[29]

贮藏期鱼肉品质劣变的主要原因是肌球蛋白的解离及肌动蛋白重链和轻链的降解，组织蛋白酶B 和L 是造成鱼肉质地劣变的关键内源蛋白酶[31]。在宰后8 h，草鱼的肌纤维间连接的断裂程度会显著增大，肌纤维及其骨架蛋白的完整性被破坏，细胞内部受到严重损伤[32]。Ladrat 等[33]在海鲈鱼蛋白水解实验中也证明组织蛋白酶B 对肌酸激酶、肌球蛋白和肌钙蛋白有降解作用；组织蛋白酶L 能降解肌动蛋白和肌球蛋白，尤其是21.5 kDa的蛋白易受其水解；组织蛋白酶D 无法降解任何肌浆蛋白；肌球蛋白重链对三者皆敏感；且在组织蛋白酶L的作用下，仅21 h 肌纤维蛋白就能被完全分解。

组织蛋白酶对鱼肉中的作用强度通常以该酶的最适pH 为基准，鱼死亡后至僵直期间的pH 从7.0 下降到6.5，此时组织蛋白酶B 和L的活性更强，因为它们的最适pH 在此区间内；宰后24 h 后pH 达到5.7～5.4，由于组织蛋白酶D 活性pH 范围更广，故在其他组织蛋白酶失活的低pH 条件下组织蛋白酶D 仍能发挥作用[34−36]。

2 内源性蛋白酶对鱼肉品质的影响

鱼肉在贮藏中的品质的变化受多种内源酶的协同调控，蛋白酶的影响并非引起品质变化的唯一因素，因此在品质评定中无法就单一内源性蛋白酶的作用而论。

2.1 风味

鱼肉的风味可以从气味和滋味两个角度评判，气味由嗅觉感知，滋味由味觉感知。曹松敏[37]揭示了风味物质的形成是内源酶及多种因素共同作用的结果，其中内源蛋白酶与制品滋味形成和蛋白降解有密切相关性。

2.1.1 气味 气味由鱼肉中挥发性物质的组成成分和含量决定，这些挥发性物质通常包括酸类、羰基化合物、醇类、酚类、烃类以及一些含氮含硫化合物[38]。新鲜的鱼肉能够散发怡人的清香，其主要成分为醇类、溴苯酚和挥发性羰基化合物等；而僵直后期的鱼肉则会生出苦味、酸味和刺激性的腥臭味，这与细菌、内源酶共同作用下生成的三甲胺、二甲胺和甲醛等小分子物质有关[39]。内源性磷脂酶和脂肪酶作用下的水解反应能够促进氧化性酸败，由此产生的游离脂肪酸可能是导致鱼类冷冻过程中风味下降的原因之一[40]。除此之外，内源酶分解蛋白产生的挥发性盐基氮（TVB-N）等氨及胺类碱性含氮物质，其含量随贮藏时间的延长而呈线性增长，该物质能准确衡量鱼类的变质程度，即含量越高蛋白质分解程度越高[41]。

2.1.2 滋味 滋味物质由非挥发性的亲水小分子或离子构成，包括多肽、氨基酸、核苷酸等含氮化合物和有机酸等不含氮化合物，含氮化合物又以谷氨酸、丙氨酸和肌苷酸等呈味核苷酸和呈味氨基酸为主。在蛋白酶的水解作用下，呈味多肽和呈味氨基酸生成，组氨酸等苦味氨基酸也在此时暴露，这是鱼肉苦味形成的主要原因[42]。组织蛋白酶B、D 和L 作为具有强降解能力的内肽酶，可将肌肉蛋白降解为可溶性肽；另一方面，对于微生物蛋白酶，由于鱼类肌肉中微生物的多样性，也可能产生兼具内肽酶和外肽酶活性的各种蛋白水解酶，这些蛋白酶的降解作用对鱼肉贮藏期风味改变起了很大的作用[43]。

2.2 保水性

保水性与鱼肉的多汁等感官属性有很好的相关性，是评价鱼肉品质的重要指标。保水性的初始值取决于鱼体肌肉的原始状态，在贮藏过程中随时间推移，蛋白质变性，肌肉骨架蛋白结构被破坏，持水能力降低，水分逐渐流失直至达到稳定[44]。

保水性的变化不仅归因于冰晶的形成、生长和分布[45]，也与内源性蛋白酶的作用息息相关。葛黎红[31]在4 ℃冰藏条件下测定内源蛋白酶活性及分布变化，发现冰藏后溶酶体内组织蛋白酶活性均有不同程度下降，同时肌浆中的酶活性在冰藏三天内迅速上升。冰藏过程中，组织蛋白酶已释放至胞浆，但由于肌纤维表面附着肌膜的阻碍，故而酶对肌原纤维的分解不会发生在冰藏过程的开始阶段[5]。一段时间后，肌膜失去保护作用，鱼肉的肌原纤维蛋白发生聚集或水解，酸诱导将一些芳香族氨基酸残基（如酪氨酸）聚集并掩埋到疏水核致使pH 降低，内源蛋白酶作用暴露疏水性氨基酸又会导致表面疏水性增加，进而影响鱼肉保水性[46]。

2.3 颜色

肌肉中肌红蛋白还原酶活性、肌肉pH 和氧化还原电位等内在因素以及光照、贮藏温度和贮藏时间等外在因素均会对鱼肉的颜色产生影响[47]。在贮藏过程中鱼肉红度和黄度等颜色强度降低可能是蛋白质水解活性增加所引起[48]。

鱼肉表面的随机光散射通常会随贮藏时间增加而增加，致使其外观发生变化，从略带蓝色的半透明变为不透明。解冻后最大的特点是细胞内外空间的增加，肌原纤维的间距更随机，细丝致密堆积。在细丝和细胞骨架蛋白网络的相互作用的变化中，钙蛋白酶和组织蛋白酶都参与了细胞骨架蛋白的降解，致使鱼类肌肉细胞内肌原纤维错乱排列，进而导致鱼肉的透明度发生改变[49]。

2.4 质地变化

除了感官评估外，客观上的肌肉组织结构变化的评价也能作为衡量冷冻贮藏过程中鱼肉品质改变的工具，肌肉蛋白的降解对其质地的变化有着极大的影响（图3）。夏静华[51]研究也证明，鱼肉嫩度的改变与钙激活酶和组织蛋白酶密切相关。

图3 蛋白降解在贮藏鱼肉质地变化中的作用模式[50]Fig.3 Role of protein degradation in texture changes of stored fish[50]

2.4.1 “软肉”的形成 相较于哺乳动物与禽类等，鱼死后低温贮藏过程中的软化无法改善嫩度、增强品质，而会导致其短期内肌肉品质下降，形成“软肉”。“软肉”的形成从肌肉内蛋白分解的角度可归因于肌纤维蛋白和胶原蛋白等结构蛋白的降解，这也是鱼肉质地变化的主要成因。

2.4.1.1 肌原纤维蛋白降解 肌原纤维蛋白是组成肌肉的主要蛋白质，肌原纤维长度与直径的改变对肉质的嫩度有直接影响，经蛋白酶降解后肌原纤维长度和直径均有显著下降，因此贮藏期“软肉”的形成与肌原纤维蛋白变化密不可分[52−53]。

贮藏初期钙蛋白酶对结构蛋白存在水解活性，但贮藏鱼肉质地上的显著改变并非在贮藏初期形成，这是由于钙蛋白酶作用程度小，其作用时肌球蛋白和肌动蛋白还未永久性结合达到初步尸僵，解僵时无法显现其酶解过程在肉质软化中的主导作用，因此贮藏初期钙蛋白酶的水解作用不会导致鱼肉质地的恶化[16,54−55]。虽然钙蛋白酶对肌原纤维蛋白的降解程度较小，初期对肉质破坏程度低，但它所造成的Z 线损失会促进其他蛋白酶的水解作用。鱼肉冷冻贮藏一周后，肌球蛋白头部区域活性明显下降，活性巯基暴露，这些巯基易于氧化或形成二硫键，加速鱼体变质进程[56]。

肌球蛋白重链、α-肌动蛋白、肌动蛋白和肌钙蛋白等多种肌原纤维蛋白与鱼肉硬度密切相关，组织蛋白酶D、B 和L 分别影响与硬度相关的17 条蛋白带中的10、9 条和4 条，尤其是组织蛋白酶D的诱导大多对鱼肉硬度产生负面作用，这意味着贮藏期间鱼肉结构变化与组织蛋白酶有关[57]。组织蛋白酶在鱼宰后初期通常为无活性状态，随着冷藏时间增加，肌动球蛋白解离程度和组织蛋白酶活性随之增加[31]。内源性蛋白酶通过影响肌原纤维结构完整性进而水解蛋白，因此可将组织蛋白酶活性和肌球蛋白解离程度作为评价鱼类品质和新鲜度的指标。

2.4.1.2 基质蛋白降解 基质蛋白这里主要指胶原蛋白，在肌肉中胶原蛋白虽不如肌原纤维蛋白含量高，但同样在维持肌肉机械性能和结构稳定性上发挥重要作用。已发现在鱼的组织器官中存在四种类型的胶原蛋白（I 型、II 型、V 型和XI 型），I 型和V 型胶原蛋白是纤维状蛋白，其二者的溶解破坏可能与结缔组织的解体有很大的关系[11]。Ando 等[58]对死后鱼肉的组织切片进行分解试验的结果表明，冷藏期间肌肉的韧性取决于细胞外基质的结构完整性，肌肉纤维间细胞外基质结构（尤其是胶原蛋白[59]）的逐渐降解是鱼死后贮藏时肉质软化的主要原因之一。为了进一步探究MMPs 对胶原蛋白的降解能力，Wu 等[60]通过电泳条带观察发现草鱼肌肉中I 型胶原在MMPs的作用下出现了明显的降解，共同作用3 h 时，胶原蛋白β链与α1链开始降解，而α2链已几乎消失，最终结果显示蛋白酶对β链的降解效果更强。

所有研究结果均指明，鱼死后贮藏中肌肉软化是组织蛋白酶、钙蛋白酶和MMPs 等内源酶对鱼肉肌纤维蛋白和胶原蛋白的水解作用所致，但这些酶的作用都不能单独解释鱼贮藏中观察到的所有变化，多种内源酶在鱼肉软化中作用的联系还需在今后研究中进一步确立。

2.4.2 鱼肉的“开裂” 除形成“软肉”外，鱼宰后冰藏出现裂口也是其质地劣变的重要表征[61]。鱼肉冰藏4～5 d 后切开会出现开裂现象，这是由于各肌肉块由结缔组织包覆，末端经胶原纤维连接，胶原纤维在内源性胶原酶作用下水解，使肌肉块间的连接处断裂，从而导致“裂口”[62]。MMP-9 已被证实在此过程中发挥重要作用[11]。

3 内源酶活性抑制技术

为抑制内源酶活性、降低肌原纤维蛋白和胶原蛋白等结构蛋白的水解，以提高鱼肉品质，许多国内外的研究者从不同方向探寻内源酶活性抑制技术，取得了一定成果。

3.1 内源酶活性抑制剂

内源酶活性抑制剂在控制内源酶引起的鱼肉劣变中应用广泛，现已从不同植物中提取内源蛋白酶活性抑制物质，均呈现较好的效果。在6 种葱属植物中，青葱和大蒜提取液能有效抑制蛋白质水解，其处理组分别比对照组草鱼鱼片剪切力提高了30%和20%[63]。同样，Ge 等[64]从大蒜中提取的大蒜素（10～100 mmol/L）在冻藏21 d 内能够明显抑制（39%～51%）粗蛋白水解酶，尤其是组织蛋白酶B、D 和L 以及钙蛋白酶，且在提取物作用21 d 时贮藏鱼肉的肌肉剪切力能够增加50%。Xu 等[65]在探究食用添加剂对冰鲜草鱼鱼片胶原酶活性和软化的抑制作用实验中，检测到儿茶素、茶多酚、没食子酸和柠檬酸钠在过冷（−1.5±0.2）℃和冰藏（0.2±0.1）℃条件下对草鱼鱼片胶原酶活性、胶原降解和鱼肉质地变化有抑制作用，结果表明，儿茶素是最有效的胶原蛋白酶活性抑制剂，其次是茶多酚和没食子酸，柠檬酸钠对胶原酶活性的抑制作用最小。

3.2 高压静电技术

高压静电技术可影响水的结构以及水与酶的结合状态而使酶失活，它能够延缓肌球蛋白重链变化，降低鱼肌肉蛋白降解程度，对肌原纤维的局部断裂碎片化有轻微的抑制作用。经高压静电处理后组织蛋白酶B、L 活性相较对照组均有所降低，组织蛋白酶H、D 活性相较于对照组无明显变化，在（−0.7±0.5）℃条件下贮藏24 d 后，静电组鱼肉细胞仍呈完整状态，而对照组细胞已呈松散的片段化[66]。

3.3 涂膜

涂膜技术在抑制鱼肉蛋白水解方面也有着突出的表现，壳聚糖单月桂酸甘油酯和丁香精油的复合涂膜显著抑制草鱼鱼片的组织蛋白酶B，B+L 和钙蛋白酶活性[67]。余达威[68]用壳聚糖-丁香精油-月桂酸单甘脂复合涂膜处理草鱼鱼片，贮藏后处理组对组织蛋白酶B、B+L 和钙蛋白酶活性抑制效果能分别达到57.5%、63.7%和35.6%，贮藏15 d 后涂膜组剪切力较对照组提高了22%～53%，其气味组成也更接近新鲜样品，从而有效抑制鱼肉蛋白降解及品质劣变。

4 结语

鱼宰后鱼体内环境失衡，内源酶仍继续作用对蛋白质进行分解，造成部分营养损失，并伴有风味、保水性、颜色和质地等品质的劣变。品质变化是一个复杂的过程，除内源性蛋白酶外，还受细菌产酶和环境因素等多种物理和化学作用影响。本论文主要论述了内源性蛋白酶在鱼肉品质变化中的作用，其中钙蛋白酶和组织蛋白酶在鱼肉中的作用机制的研究较成熟，但基质金属蛋白酶的研究多集中于医学领域，食品中基质金属蛋白酶的作用机制及其对鱼肉品质的影响仍有待探究。此外，内源性蛋白酶抑制技术尚未成熟，酶抑制剂提取过程繁琐，提取成本高，在规模化生产中也受到较多限制，还没有达到规模化生产。因此，在以后的研究中，有必要考虑环境、细菌酶和多种内源酶联合调控等多种因素，深入探寻其对鱼肉产品品质的影响，指出鱼肉品质控制技术具体发展方向。同时，在蛋白酶抑制剂开发中，应尽可能降低提取成本，简化提取过程，提高提取效率。此外，还应建立实用的鱼类新鲜度和腐败程度判定标准，以指导工业生产，满足消费者对高品质鱼肉的需求。