微生物产蛋白酶的研究进展

艾雨晴，陈松骏，秦 娟，于 双，李 萌，赵前程，李 莹（大连海洋大学食品科学与工程学院，辽宁大连 116023）

蛋白酶是能够水解蛋白质中肽键结构，产生氨基酸或多肽的一类酶的总称，是一种重要的工业酶，在全球酶总产值中占60%左右[1−2]，广泛应用于食品、医药、洗涤及饲料等领域[3]。蛋白酶分布广泛，种类繁多，根据酶对底物作用方式的不同，可以将其分为内肽酶与外肽酶。内肽酶从蛋白质的内部切割肽键，产生小分子的蛋白䏡或蛋白胨，外肽酶则从蛋白质的-COOH 或-NH2端逐个切割，产生游离氨基酸，用于工业生产的蛋白酶以内肽酶为主[4]。根据酶的活性中心不同，可以将蛋白酶分为天冬氨酸蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶[5]。根据酶反应的最适pH 不同，可以将蛋白酶分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。根据蛋白酶的来源不同，又可以将蛋白酶分为动物蛋白酶、植物蛋白酶和微生物蛋白酶，与动植物蛋白酶相比，微生物蛋白酶具有种类丰富、不受原料限制、提取工艺简单，易于实现工业化生产等优点，因此，微生物产蛋白酶已成为蛋白酶制剂的主要来源，工业上超过三分之二的蛋白酶来自于微生物发酵生产[6−7]。近年来，新型蛋白酶的发掘、高产蛋白酶菌株的选育、蛋白酶的改性仍是国内外研究的热点[8−9]。本文分别从微生物产蛋白酶的工业化生产菌种、高产菌株的选育、酶学性质、分离纯化方法及在食品行业中的应用五个方面进行梳理总结，阐明了微生物蛋白酶的研究现状及发展方向，为进一步研究和发掘微生物产蛋白酶，促进蛋白酶的工业化生产奠定基础。

1 产蛋白酶的工业化生产菌种

产生蛋白酶的微生物种类繁多，作为工业生产应用菌株，需要具备高产、无毒和无致病性等条件[10]。目前，工业上常用细菌、霉菌和放线菌作为发酵生产蛋白酶的菌种[11]，细菌蛋白酶通常采用液体深层培养法进行发酵生产，而霉菌蛋白酶则可采用固态培养法进行发酵生产，微生物产蛋白酶的主要工业化菌株如表1 所示。

表1 产蛋白酶的主要工业化菌株Table 1 The main industrial strains producing protease

工业上酸性蛋白酶的生产菌种主要是霉菌中的黑曲霉、米曲霉和宇佐曲霉，另外，担子菌和酵母菌也可用于生产酸性蛋白酶[26]。1954 年日本研究员首次发现黑曲霉可以产生酸性蛋白酶，随后大量霉菌性蛋白酶产生菌被发现[12]。我国上海工业微生物所首次筛选出一株产酸性蛋白酶的黑曲霉菌株3.350，并用于工业生产，填补了我国酸性蛋白酶工业化生产的空白[13]。米曲霉3.042 菌株、宇佐美曲霉537 菌株和宇佐美曲霉L336 菌株也常作为酸性蛋白酶的生产菌株，现有的酸性蛋白酶高产菌株大多是由以上菌株选育获得[14−17]。

中性蛋白酶可以有效地水解大豆原料中的蛋白质，常用于酱油的酿造，其高产菌株集中在曲霉属和芽孢杆菌属，曲霉属菌株以米曲霉为主[27]，芽孢杆菌属的菌株包括枯草芽孢杆菌、耐热解蛋白芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等[28−31]。米曲霉是国际公认的食品安全微生物，其所产生的胞外酶系复杂，在这些酶系中，以中性蛋白酶和淀粉酶为主[30]。米曲霉AS3.951（沪酿3.042）、米曲霉NRRL 1808、米曲霉CICIM F0899 和米曲霉ZW-06 等菌株均能高产中性蛋白酶[18−21]，但不同菌株产生的中性蛋白酶在产酶条件和酶学性质上存在较大差异。枯草芽孢杆菌和耐热芽孢杆菌产生的中性蛋白酶是代表性中性蛋白酶，我国工业上采用枯草芽孢杆菌AS1.398发酵生产中性蛋白酶已有多年的历史[22]。从新疆吐鲁番火焰山土壤里分离得到的一株耐热芽孢杆菌XJT9503，能够产生高温中性蛋白酶[31]。于平等[28]从土壤中分离得到一株能够产新型中性蛋白酶的蜡样芽孢杆菌。

可产生碱性蛋白酶的微生物有很多，但用于工业化生产的菌株主要集中在芽孢杆菌属和链霉菌属，如地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、灰色链霉菌、费氏链霉菌等[32]。1945年瑞士Jaag 等[33]在地衣芽胞杆菌中发现了碱性蛋白酶，由于其水解能力强且易于工业化生产，因此成为酶学研究领域的热点。我国最早用于碱性蛋白酶工业化生产的微生物是地衣芽孢杆菌2709[23]，随后分离获得的地衣芽孢杆菌C1213、短小芽孢杆菌289及短小芽孢杆菌209 也相继应用于工业化生产碱性蛋白酶[24−25]。

目前，我国蛋白酶产业日趋成熟，所用的菌株也比较稳定。但常用的工业化生产菌株集中在细菌和霉菌的少数菌属，种类不够丰富，使用的菌株及工艺多年来缺少更新，产量与国外相比还有差距。另外，随着蛋白酶在工业上的广泛应用，特殊功能蛋白酶的需求日益增加，如嗜热、嗜冷、耐盐蛋白酶等。因此，选育现有工业化菌株的蛋白酶产量，寻找并开发新型微生物源蛋白酶，是微生物产蛋白酶的热点研究方向。

2 高产蛋白酶菌株的选育

能够产生蛋白酶的微生物种类繁多，但是野生型的菌株蛋白酶产量往往不能满足工业化生产的需求。因此，通常利用遗传学的原理和技术，对野生型的菌株进行遗传改造，以提高蛋白酶的产量，获得适用于工业化生产的工程菌株[34]。常用的微生物遗传育种方法包括诱变育种、原生质体融合、基因工程和蛋白质工程育种。

2.1 诱变育种

诱变育种是利用物理或化学因素进行诱变处理，结合高效的筛选手段，获得高产蛋白酶的突变菌株，前者包括紫外线、激光、X-射线和γ-射线等，后者包括烷基化试剂、碱基类似物和亚硝酸等[35]。舒冬梅等[36]以米曲霉菌株WT415 为出发菌株，经过紫外诱变，其酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶酶活分别提高了14.87%、48.85%和21.47%。除了单因素诱变以外，多因素复合交替诱变能够扩大突变范围，往往更能获得具有优良性状的突变菌株。刘文龙等[37]采用等离子体和紫外线复合交替诱变黑曲霉LD-015 菌株，经过筛选获得一株高产突变株，其酶活比出发菌株提高了83.71%，并且遗传性状稳定。近年来，一些新型诱变技术，如超临界CO2、ARTP 和脉冲磁场等，也被用于高产蛋白酶菌株的诱变选育，张咪等[38]用脉冲磁场诱变枯草芽孢杆菌，诱变菌株的中性蛋白酶产量提高了17.7%。

2.2 原生质体融合育种

原生质体融合育种是利用两个或多个含有不同遗传性状的亲本，通过原生质体融合使基因发生重组，将亲本的优良性状集中在子代的一种育种技术。潘延云等[39]利用原生质体融合技术，将地衣芽孢杆菌2709 与枯草芽孢杆菌BD105 进行融合，获得1 株高产碱性蛋白酶的融合菌株A16，其酶活与地衣芽孢杆菌2709 比提高50%。Xu 等[40]以米曲霉HN3042 和黑曲霉CICC2377 为出发菌株进行原生质体融合，获得了10 株酸性蛋白酶活性提高50%以上的融合株。

2.3 基因工程育种

基因工程育种是利用分子生物学技术，定向改造微生物的遗传物质，从而创造出更适合工业化生产的工程菌株，广泛应用于高产蛋白酶菌株的选育。Tang 等[41]将地衣芽孢杆菌2709的碱性蛋白酶基因apr，在枯草芽孢杆菌WB600 中进行表达，获得重组枯草芽孢杆菌BW-016，其碱性蛋白酶酶活增加65%。Shin 等[42]克隆了麦氏弧菌RH530的碱性蛋白酶基因vapK，将经过DNA 改组的vapK基因转入麦氏弧菌KS1，构建表达碱性蛋白酶的重组麦氏弧菌，与野生型RH530 菌株相比，碱性蛋白酶活性提高了43 倍。Zhou 等[43]在地衣芽孢杆菌中分别敲除了产孢相关基因sigF和sigE，两个基因缺失菌株在产蛋白酶方面均表现出优越的性能，最高产蛋白酶量达（29494±1053）U/mL，比野生型菌株高出约19.7%。

2.4 蛋白质工程

蛋白质工程是通过对合成蛋白酶的基因进行有目的的设计和改造，从而改变蛋白酶的初级结构及其特性，该技术是提高蛋白酶的稳定性、专一性和抗氧化性的有效手段。Zhao 等[44]将双位点突变（W106K/V149I 和W106K/M124L）引入短小芽孢杆菌碱性蛋白酶，提高了短小芽孢杆菌碱性蛋白酶的冷活性和热稳定性。Nautiyal 等[45]将烟草病毒的蛋白酶C-末端加入一个含有12 个残基的肽段，重组蛋白酶的溶解度显著提高，从而增强了酶的活性。Ke 等[46]构建了不含信号肽的截短酱油曲霉GIM3.33 碱性蛋白酶，并在毕赤酵母KM71 菌株中高效表达，重组的碱性蛋白酶具有更加广泛的底物特异性，是食品工业副产品加工的理想工具。

随着现代生物技术的发展，菌株的选育已广泛应用于工业化生产，蛋白酶的产量和质量都有了质的飞跃。各种选育技术之间并不是相互孤立的，而是相互关联相互交叉的，工业化菌株往往是多种选育技术叠加的产物。近年来，基因工程和蛋白质工程已成为蛋白酶选育和改造的热点研究方向，在提高蛋白酶产量和改善蛋白酶性质方面，发挥了巨大作用。

3 微生物产蛋白酶的酶学性质

酸性蛋白酶的活性中心通常含有2 个天冬氨酸残基，其最适pH 往往较低，因此属于天冬氨酸蛋白酶。微生物产酸性蛋白酶大多来自真菌中的霉菌，细菌中极少存在酸性蛋白酶。不同微生物产酸性蛋白酶对抑制剂的敏感度不同，十二烷基硫酸钠和重氮酮化合物是主要抑制剂，但通常不受胃蛋白酶抑制剂对-溴苯的抑制[47]。黑曲霉产生的A 型蛋白酶仅被重氮酮化合物部分抑制，而黑曲霉产生的B 型蛋白酶除了受重氮酮化合物抑制外，还受二硫代双2-硝基苯甲酸及1,2-环-3-对硝基苯氧基丙烷的抑制[48]。酸性蛋白酶最适pH 为2.5～5.0，微生物产酸性蛋白酶反应的最适pH 通常在3.0 左右，如黑曲霉和酵母菌酸性蛋白酶[49]。酸性蛋白酶反应的最适温度为30～50 °C，如黑曲霉酸性蛋白酶反应的最适温度为50 °C，在40 °C 条件下酶活力几乎不受影响，而在70 °C 条件下的相对酶活仅为9.3%[50]。

中性蛋白酶的活性中心往往含有二价锌离子，因此属于金属蛋白酶，活性依赖于其含有的二价金属阳离子，金属螯合剂对其具有抑制作用[51]。微生物产的中性蛋白酶是微生物蛋白酶中最不稳定的酶，很容易自溶，大多来自曲霉属和芽孢杆菌属。米曲霉中性蛋白酶最适反应pH 和最适反应温度分别介于7.0～9.0、50～55 °C，耐热性较差。芽孢杆菌中性蛋白酶最适反应pH 和最适反应温度分别介于6.8～8.5、40～70 °C，热稳定性要优于米曲霉中性蛋白酶，少数芽孢杆菌中性蛋白酶能够耐高温，如张蕾等[52]分离纯化获得的中性蛋白酶最适反应温度高达75 °C，是一种细菌耐热中性蛋白酶。

已发现的微生物产碱性蛋白酶活性中心大多含有丝氨酸，属于丝氨酸蛋白酶，受二异丙基氟磷酸和苯甲基磺酰氟的抑制，Ca2+能够激活酶的活性或是稳定酶的结构。Hutadilok 等[53]从芽孢杆菌PS719 中分离纯化得到的碱性蛋白酶，受苯甲基磺酰氟、Fe2+和Cu2+抑制，Ca2+能够激活酶活性。大多数碱性蛋白酶的最适pH 范围在9.0～11.0 之间，但是微生物产碱性蛋白酶具有更加广泛的pH 范围。Fujiwara等[54]在芽孢杆菌B18 中纯化出的碱性蛋白酶最适反应pH 为12.0～13.0，在pH 为5.0～12.0 范围内均能稳定存在。Shanmughapriya 等[55]从海洋玫瑰杆菌MMD040 中分离出的碱性蛋白酶最佳反应pH 为8.0，在pH 为6.0～9.0 范围内均具有较强活性。大多数碱性蛋白酶最适温度介于50～70 °C 之间，Lee 等[56]从热放线菌中分离出来的丝氨酸蛋白酶，最适反应温度为85 °C，属于耐热碱性蛋白酶。Zhu 等[57]从产黄青霉菌中分离出的低温碱性蛋白酶，最适反应温度为35 °C，超过50 °C酶活则急速下降。微生物产蛋白酶的酶学性质如表2所示。

表2 微生物产蛋白酶酶学性质Table 2 Enzymatic properties of protease produced by microorganism

微生物产蛋白酶普遍具有稳定性较强的特点，一般适用温度和pH 范围较广，对抑制剂的耐受性较强，因此，微生物产蛋白酶应用范围很广，涵盖洗涤剂配方、皮革加工、谷物压榨、酿造、食品加工等众多领域。微生物产蛋白酶能够广泛应用于各行各业的另一因素是其生产成本低，而成本除受蛋白酶产量的限制外，还受蛋白酶的分离纯化难易程度限制。

4 微生物产蛋白酶的分离纯化

商品化的蛋白酶往往需要较高的纯度，已经制成结晶或得到高度纯化物的蛋白酶商品达100 多种[11]。与动物源和植物源蛋白酶相比，微生物产蛋白酶的提取工艺相对简单，且不受脂肪干扰，发酵液经过离心去除菌体细胞后，即得粗酶液[58]。粗酶液的进一步纯化常采用沉淀法、膜超滤法和色谱法等[59−61]。

微生物产蛋白酶与动植物蛋白酶同功不同源，其生产方式及理化性质的差异，决定其提取纯化的方法不尽相同。每种纯化方法都有其自身的优缺点，因此，通常采用多种纯化方法串联使用来达到最佳的纯化效果[62]。Huang 等[63]从亨氏曲霉HX08 中分离出的酸性蛋白酶AP3 时，粗酶液经硫酸铵沉淀、DEAE-Sepharose CL-6B 离子交换层析和Sephacryl S-200 凝胶层析三步纯化，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定其分子量为33 kDa。Ghorbel 等[64]先后采用膜超滤、热变性沉淀、Sephacryl S-200 凝胶层析、DEAE-纤维素离子交换层析的方法将蜡样芽孢杆菌BG-1产生的钙依赖性蛋白酶纯化至均一，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测在34 kDa 处存在单一条带。

传统的蛋白酶分离纯化方法仍存在许多问题，如结合效率不高、操作耗时、设备昂贵等。随着分离技术的不断发展，许多新方法应用于微生物蛋白酶的分离纯化。Benmrad 等[65]应用FPLC 离子交换色谱和HPLC-ZORBAX PSM 300 HPSEC 凝胶过滤色谱对平菇来源的耐热蛋白酶进行了纯化。Rathnasamy等[66]报道了用天然深共晶溶剂（NADES）从蜡样芽孢杆菌中提取纯化纤溶蛋白酶的研究。该方法提取蛋白酶达到190 U/mL，再经阴离子交换柱纯化后，酶活为2607.8 U/mL。Ortiz-Hernandez 等[67]开发了一种快速和准确的荧光分析方法来分析连接到纤维素膜和琼脂糖凝胶上的酰胺基，该方法包括酰胺基与乙二醛和芳香醛的反应，形成荧光团，可通过荧光光谱和成像进行分析和定量。这些功能化多孔基质在丝氨酸蛋白酶的纯化中有着重要的应用。Siqueira等[68]在聚乙二醇/磷酸盐双水相体系中，采用不连续和连续工艺提取溜曲霉URM4634 产生的蛋白酶。在最佳操作条件下，连续萃取和非连续萃取分离效率分别达到95.3%和90.0%。

微生物蛋白酶的分离纯化方法多种多样，其成本也有巨大差异，既可以应用色谱-质谱连用等大型设备进行分离获得高纯度蛋白酶用于科学研究，也可以用简单的硫酸铵沉淀和层析进行粗分离应用于食品、饲料等行业。因此，要根据具体应用来选择相应纯度的蛋白酶。

5 微生物产蛋白酶在食品行业的应用

随着生活水平的提高，人们对食品风味、口感和营养等方面的要求越来越高，蛋白酶是食品工业中最重要的一类酶，对提高食品品质、安全和营养具有重要作用[69]。在食品加工过程中，往往需要具有特殊功能或是活性的蛋白酶，而微生物是特殊用途蛋白酶的重要来源，因此，微生物产蛋白酶在食品行业中具有广泛的应用前景。

5.1 在肉类加工中的应用

嫩度是评价肉制品品质的重要指标，经蛋白酶处理能够起到肉质嫩化的作用[70]。米曲霉产生的酸性蛋白酶能够有效降解肌肉中的肌原纤维蛋白和胶原蛋白，在肉类加工中起到改善肉质，增加肉类嫩度的作用[71]。He 等[72]将深海冷适应菌Pseudoaltermonas sp.SM9913 产生的低温蛋白酶和Bacillus sp.SM98011产生的中温蛋白酶分别喷洒在海鱼、猪肉和虾仁表面，结果表明，经低温蛋白酶处理的冷冻肉样品，比经中温蛋白酶处理的样品释放出更多的味觉氨基酸和必需氨基酸。因此，低温蛋白酶在改善冷藏肉的风味方面具有潜力，而微生物是低温、耐热和耐盐蛋白酶的重要来源。

5.2 在保健食品中的应用

微生物产蛋白酶本身具有抗血栓、抗肿瘤、抗感染等作用，在功能性成分提取的过程中也发挥重要作用，因此，微生物产蛋白酶在保健食品行业具有广泛的应用前景[69]。Cheng 等[73]从海洋芽孢杆菌中分离得到一种钙依赖的碱性蛋白酶，具有高纤溶活性，可用于抗血栓保健食品的研发。纳豆激酶是由枯草芽孢杆菌产生一种丝氨酸蛋白酶，由于其具有良好的抗血栓活性而备受关注。Thu 等[74]从虾壳中分离获得的一株枯草芽孢杆菌C10 菌株，其产生的纳豆激酶纤溶活性高达400 U/mg 左右，在保健食品行业极具商业价值。姜光域[75]从沙蝉消化道分离出一株微生物，其产生的胞外蛋白酶D2 对鼠乳癌细胞EMT6增殖具有明显抑制作用，显示出一定抗肿瘤活性。Ghanshyam 等[76]从印度西海岸分离出一株能够产生胞外有机溶剂稳定的蛋白酶产生菌，该胞外蛋白酶具有促进伤口收缩愈合的作用。近年来，保健食品行业快速发展，功能性多肽和多糖产品备受关注，由于海洋特殊的生活环境，导致海洋生物体内物质的合成过程与陆生生物不同，并产生许多结构新颖、作用特殊的活性多肽和多糖，蛋白酶在多肽的制备及多糖的提取起到了关键的作用。Miao 等[77]采用复合蛋白酶酶解牡蛎肉制备的牡蛎多肽，具有抗氧化和抗疲劳活性，在保健和治疗慢性病方面有很好的应用前景。Chen 等[78]采用中性蛋白酶酶解法制得的贻贝多糖，具有良好的抗氧化活性，可作为保健食品中的天然抗氧化剂。

5.3 在其他食品加工过程中的应用

在干酪的制作过程中加入枯草芽孢杆菌产生的碱性蛋白酶能够水解κ-酪蛋白，代替凝乳酶完成干酪加工，解决凝乳酶短缺这一限制干酪加工发展的难题[79]。在一些调味品发酵过程中，米曲霉产生的耐盐蛋白酶能够有效降解蛋白质，减少苦味肽的产生，促进风味物质的形成[11]。在酿酒工业中，蛋白酶常用于去除啤酒中的蛋白质，一般在巴氏消毒前加入蛋白酶，以减少啤酒混浊现象的发生，因此，嗜热微生物中的蛋白酶可应用于啤酒的澄清[80−81]。研究人员在不断开发具有特殊功能的微生物产蛋白酶，如低温蛋白酶、耐热蛋白酶、高稳定性蛋白酶和广泛底物范围蛋白酶等，用以开发新型食品、改良食品品质和改进食品加工工艺。随着研究的深入，微生物产蛋白酶将会在食品行业中发挥更大的作用。

6 存在问题及展望

目前国际上商品化的微生物产蛋白酶多达100多种，但是仍然存在微生物产蛋白酶资源开发不足的问题，采用宏基因组技术在环境中分离筛选高效蛋白酶或是新型蛋白酶，如低温蛋白酶、耐热蛋白酶等，以满足各行各业的特殊需求，丰富微生物产蛋白酶种类，是未来研究的一个发展趋势。随着分子生物学技术手段的发展，我国微生物产蛋白酶的研究也已从酶的结构和性质研究，深入得到利用蛋白质工程选育高产菌株和改善酶的性质。随着研究的进一步深入，微生物产蛋白酶必将在实际应用中发挥更大的作用。