非热加工技术在低或无致敏婴幼儿配方粉中应用的研究进展

刘 迪，丛艳君

（北京工商大学食品与健康学院，北京市食品营养与人类健康高精尖创新中心，北京市食品添加剂工程技术研究中心，北京 100048）

母乳是婴儿的最佳食物[1]。当母乳不足时，通常会使用以牛乳为基料的婴儿配方粉作为替代品[2]。但是这种替代品可能导致一些婴幼儿发生过敏反应，即牛乳蛋白过敏（cow milk protein allergy，CMPA）[3]。

CMPA 是一种复杂的疾病，是由IgE 和非IgE介导的过敏反应。过敏原和抗原提呈细胞（antigen presenting cells，APCs）在启动特异性免疫反应中起着重要作用（如图1）。在APCs的刺激下，前体细胞Th0（T 辅助）可以分化为两种类型：分化为Th1 细胞的途径受白细胞介素（interleukin，IL）-12的诱导，Th1 细胞产生的特征细胞因子包括IL82、IL-15 和干扰素γ（interferon gamma，IFNγ）；分化为Th2 细胞的途径受到IL-4的诱导，释放的特征细胞因子包括IL-5、IL-10 和IL-13。最重要的是，Th1 和Th2 反应是相互抑制的。例如，IL-4 和IL-10 抑制Th1 反应，而IL-12 和IFNγ抑制Th2 反应。这种交叉抑制反应通常会导致一种混合表型，但可能在个体中偏向于一种途径，这取决于遗传背景、抗原暴露水平和致病环境因素。在即时型牛乳过敏反应中，Th2 途径为主导，IL-4 和IL-13 诱导浆细胞产生IgE，从而导致IgE 介导的过敏。同时，Th2 分泌的IL-5 可能导致非IgE 介导的过敏，这主要是由于嗜酸性粒细胞的积累和激活引起的[4]。

图1 过敏反应的免疫机制图Fig.1 The immunological profile during an allergic response

CMPA 通常在婴儿期更为严重[3]，会引起一系列临床症状，包括皮肤（麻疹、湿疹和肿胀）、胃肠道（恶心、呕吐、腹泻和胃痉挛）、呼吸道（流鼻涕、鼻塞、喘息和咳嗽），甚至更严重的过敏性休克等反应[5]。在用母乳、配方粉混合喂养的婴儿中，由于饮食中包含牛乳蛋白，同样可以列入CMPA的研究。在仅用母乳喂养的婴儿中，牛乳蛋白过敏的发生率很低。此外，母乳中存在的免疫调节物质，以及母乳和配方粉喂养的婴儿中肠道菌群组成的重要差异，也是影响CMPA 发生的重要因素[6]。

关于热加工降低食物致敏性的研究已经有许多报道[7−10]。本文重点讨论非热加工包括酶解、高压、微波、发酵及其辅助酶解对于牛乳过敏原的结构和致敏性的影响，及其在制备低致敏婴儿配方粉方面的应用,为新型低或无致敏婴儿配方粉的生产提供理论基础，也对今后非热加工技术的发展和研究提出建议。

1 CMPA的管理

通过限制或改变饮食，避免食用牛乳蛋白，一般可以预防和改善婴儿过敏性疾病。但是，很多食品中往往添加有牛乳蛋白，完全避免食用是不现实的。对于处于骨骼生长期的儿童，牛乳也是钙的重要来源[11]。因此，改性牛乳蛋白以加强对CMPA的管理显得格外重要[12]。食品工业中，降低牛乳蛋白致敏性的方法主要包括热处理[13−15]、微波加热[16−18]、酶解[19−21]、乳酸菌发酵或水解[22−24]、高压[25−28]以及水解与高压、微波等技术的联合应用等[29−32]。非热加工技术，对牛乳的营养组成和感官特性影响小，同时又能降低牛乳蛋白质的致敏性，成为近年来研究的关注点。“低致敏食品”便相应产生，虽然目前没有任何法律上的定义或标准来规范这一概念，但相较于天然食物，这类食品在体内可显著降低过敏反应发生的几率[33−34]。那些经过食品加工技术（水解、热处理和/或超滤）处理的能破坏或者灭活IgE 结合表位的牛乳配方食品[35]，也属于“低致敏食品”范畴。双盲、安慰剂对照试验表明，这类食品可以使90%（95%的置信度）以上的过敏个体具有良好的耐受性[33−34]。

2 乳致敏蛋白及其表位

牛乳蛋白在过敏反应中的作用机制尚不清楚[36]。牛乳含有大约30～35 g/L的蛋白质，含25 种以上不同的蛋白质，但过敏原往往只是其中几种[37]。一般来说，根据蛋白质在低pH 下溶解度的差异，牛乳蛋白可分为酪蛋白（80%）和乳清蛋白（20%）两类。酪蛋白（casein，CN）组分在pH4.6 下不溶，主要包括α−s1−、α−s2−、β-和κ-酪蛋白4 种组分，比例分别为4:1:4:1。乳清蛋白在pH4.6 条件下可溶，包括β-乳球蛋白（β-lactoglobulin，BLG）和α-乳白蛋白（αlactalbumin，ALA），还包括少量的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）、乳铁蛋白、乳过氧化物酶和免疫球蛋白等[38]。临床研究表明，患CMPA的儿童对牛乳中过敏原的B 细胞表位发生过敏反应，这些表位可能存在于蛋白质序列的任何区域。引起儿童过敏反应的主要牛乳过敏原为BLG、ALA 和αs1-CN。对已知的主要过敏原分子特征进行研究，有助于提高过敏者产生牛乳耐受性的治疗方案的制定，并可为生产低致敏配方粉提供技术支持[39]。

β-乳球蛋白（BLG）占乳清蛋白总量的50%，免疫反应序列有规律地分布在BLG 分子的162 个氨基酸残基上，其中一些是短的线性序列，而另一些是构成构象表位的大片段。BLG 中有3 个肽已被确定为主要的致敏表位，包括f41～60，f102～124 和f149～162。根据其晶体结构，f149-162 肽的C 端形成了一个短的α-螺旋[40]。Jarvinen 等[41]在BLG 分子上鉴定了7 个（片段：1～16、31～48、47～60、67～78、75～86 和127～144）IgE 结合以及4 个（片段：49～60、119～128、129～138 和143～152）IgG 结合区域。利用丙氨酸扫描分析，鉴定了氨基酸序列f17～36、f72～86、f92～106 和f152～166 为IgE 结合表位[42]。另外，肽f41-60 和f102-142 在分子表面形成环，抗体也可以接触到它们[43]。基于微阵列的免疫分析技术表明，75%以上的患者可识别f58～77、f76～95 和f121～140 序列[44]。

ALA 是一种单体球状蛋白质，由123 个氨基酸残基组成，分子量为14.4 kDa，有4 个二硫键[45]。序列分析表明，牛乳与人乳ALA的氨基酸序列之间具有高度的同源性约75%的相似性。尽管如此，牛乳ALA 已经被确定为主要牛乳过敏原之一[37]。已经鉴定了ALA 上的4 个（片段：1～16、13～26、47～58和93～102）IgE 结合以及3 个（片段：7～18、51～61和89～108）IgG 结合区域[41]。另一项关于CMPA 变应原性的研究表明，ALA 氨基酸序列中有5 个IgE 结合位点，包括f1～15、f6～20、f46～60、f71～85和f101～115。另外，分别在f6～20、f21～35、f36～50和f86～100 处鉴定了4 个IgG 结合表位[44]。

αs1-CN 是由199 个氨基酸残基组成的单链线性磷酸蛋白，是牛乳中含量较高的蛋白质，被认为是酪蛋白中最有效的诱导特定过敏反应的蛋白。这种蛋白质只有少量的二级结构（α-螺旋或β-片层），由于缺乏二硫键，导致三级相互作用减少[45]。使用重叠的十肽，在αs1-CN 上已经鉴定了六个主要（片段：17～36、83～102、109～120、139～154、159～174 和173～194）和三个次要（片段：39～48、69～78 和123～132）IgE 结合以及5 个主要（片段：15～36、93～108、143～160、159～174 和173～186）和一个次要（片 段：1～10）IgG 结合区域，其中f69～78 和f173～194 两个IgE 结合表位可能有助于预测单个患者的CMPA，并且，表位f69～78 被大多数患者的IgE 抗体识别，但没有被任何患者的IgG 识别，这种差异可以通过IgE 和IgG 抗体对该表位的不同亲和力来解释，但也可以表明表位是造成过敏原特异性的原因。此外，Spuergin 等[46]对αs1-CN的三个肽序 列（片 段：19～30、86～103 和141～150）进行了表征，它们与15 名过敏患者的血清发生了反应，这些表位位于分子的疏水区域，只有在酪蛋白变性后这些表位才能接触到抗体。Cerecedo 等[47]研究表明，75%以上的患者识别了f16～35、f28～50 和f73～92。本团队通过丙氨酸扫描分析法在αs1-CN 中发现了IgE 结合表位（片段：aa6～20，aa11～25，aa76～90，aa126～140，aa171～185）和IgG 结合表位（片段：aa21～35，aa56～70，aa161～175），并且发现两个氨基酸区域与IgE 和IgG 均发生免疫反应[45]。以上研究中，表位的序列定位不同，这可能与不同国家的血清学差异有关，另外，与不同的研究方法也有关，比如，在持续性CMPA 中，αs1-CN的IgE 和IgG 识别模式支持线性表位。

与αs1-CN 相比，关于β-CN 和κ-CN的致敏表位的数据非常少。在β-CN 中鉴定了6 个主要（片段：1～16、55～70、83～92、107～120、135～144 和185～208）和3 个次要（片段：149～164、167～178、173～184）IgE结合表位，以及八个主要（片段：1～14、23～34、55～68、79～92、107～120、135～144、149～160 和183～208）和一个次要（片段：169～184）IgG 结合表位。同样，在κ-CN 中检测到8 个主要的（片段：9～26、21～44、47～68、67～78、95～116、111～126、137～148 和149～166）IgE 结合表位，以及2 个主要的（片段：55～80 和105～116）和2 个次要的（片段：15-24 和37-46）IgG结合表位[48−49]。Cerecedo 等[47]证实75%以上的患者在αs2-CN 中识别了f1～20、f13～32、f67～86 和f181～207的氨基酸序列，在β-CN 中识别了f25～50、f52～74 和f154～173的氨基酸序列，在κ-CN 中识别了f34～53的氨基酸序列。

目前，对于介导牛乳蛋白过敏的IgE 或IgG的机制及二者相互转化的机理仍有较大的争议，造成这种情况的原因可能是，研究群体的不同，研究群体选择标准不同及样本量小。

3 非热加工牛乳过敏原处理技术

3.1 高压辅助酶解处理

高压（high pressure，HP）会影响蛋白质氢键、离子键、疏水键等非共价键，破坏三级、四级结构，但对共价键没有影响[27,50]。研究表明，HP 可以通过影响食物过敏原的结构来改变过敏原的致敏性[26,28]。在高压下水解蛋白质是一种新的底物酶解方法，但仅在高压条件下蛋白质是几乎不水解的。HP 可以改变蛋白质分子内和蛋白质-溶剂之间相互作用的平衡，压力引起的蛋白质变化的程度取决于蛋白质的天然结构、离子强度、温度、溶剂、pH 和施加压力的水平等因素。因此，压力可以有效地促进酶对蛋白质的水解作用[29]。

可以采用HHP 与食品级酶的联合作用来减少抗原蛋白[26]。酶结合高静水压（high hydrostatic pressure，HHP）处理得到的牛乳蛋白水解物可用于低致敏性婴儿配方粉的生产[31]。与热处理效应相比，HP 过程中蛋白质的变性和聚集存在显著差异。研究人员发现，用HP 处理的乳清蛋白水解物的抗原性低于热处理的水解产物[50]。除了HP 对牛乳蛋白过敏性的积极影响外，一些研究报道了这种处理的负面影响[27]。Kleber 等[27]的研究结果表明，牛乳过敏原BLG 经200～600 MPa HHP 处理后反而变得更加活跃，HHP 会增加过敏原BLG的致敏性，因为结构的改变可能会暴露出新的线性表位，增加与IgE的结合机会。

虽然最早用HP 处理的食物是牛乳，有许多研究集中在HP 对牛乳的改性上，但到目前为止，HP 处理的牛乳产品还没有商业化生产。限制这项技术应用的主要因素是成本，因为HP 处理是一项昂贵的技术，而且，相比其他食物的变化，HP 引起的牛乳变化还需要更进一步研究[51]。

3.2 微波辅助酶解处理

微波（microwave irradiation，MWI）是一种高频电磁波，属于非电离辐射，在该系统中，温度升高不同于传统加热方式，是通过吸收微波能量来实现的，微波能量的吸收通过偶极水分子的旋转和物质的离子组分的平移来实现。微波可以影响牛乳蛋白构象变化，加速其变性[16,29]。另外，据报道经微波处理后过敏原上的表位结构发生了改变，由此可见，微波技术可用于降低蛋白质的致敏性[52]。

乳清蛋白（ALA 和BLG）经微波处理后失去了部分IgG 结合能力，但其抗原活性并未完全消除。事实上，微波本身不足以大大降低或完全消除BLG的抗原性，因此应与其他处理方式（如酶处理）或内在参数（pH）相结合来应用[17]。

近年来，对微波和酶法联合降低乳清蛋白的抗原性进行了多项研究[30,32,53]。这些研究表明，MWI 提高了BLG 和乳清分离蛋白（whey protein isolate，WPI）的水解速率，在200 W的微波处理3 min，显著提高了胃蛋白酶对BLG的水解速度，并且显著降低了其免疫反应性。但是，微波辅助胰蛋白酶、糜蛋白酶以及两种酶的混合物处理BLG 和WPI，所得深度水解物与IgE 结合没有影响[32]。Izquiedo 等[30]研究表明，链霉蛋白酶和糜蛋白酶在MWI 下显示出较高的活性，可以加速BLG 水解。一年后，这些作者分析了MWI 对链霉蛋白酶、糜蛋白酶和5 种食品级酶（木瓜蛋白酶、Corolase7089、PN-L100、碱性蛋白酶和中性蛋白酶）水解乳清蛋白的影响，发现链霉蛋白酶、木瓜蛋白酶和碱性蛋白酶能产生更有效的低致敏乳水解产物，并且能够降低产品的苦味[53]。

因此，MWI 辅助酶处理得到的乳蛋白水解物可以作为eHFs 中多肽的来源。虽然微波辅助酶解是降低BLG 致敏性和生产低致敏配方粉的有效方法，但是进一步揭示MWI 对乳蛋白（如BLG 等）致敏特性影响机制非常有必要。

3.3 发酵辅助酶解处理

发酵是食品工业中最古老的加工技术。乳酸菌（lactic acid bacteria，LAB）发酵过程中牛乳蛋白发生水解反应可能对提高牛乳消化率和加速生物活性肽的产生有重要影响。而且，蛋白水解可以破坏过敏原的作用表位，降低牛乳的致敏性[23]。最近，人们对乳酸菌的免疫调节机制产生了很高的兴趣。一些微生物、动物或植物的蛋白酶也被用来水解牛乳蛋白，降低其抗原性，然而，在水解过程中产生的一些苦味肽极大地影响了低致敏乳制品的开发。而乳酸菌发酵过程中的水解作用不仅降低了乳蛋白的抗原性，并且水解物口感良好富集较多生物活性物质[23]。

乳酸菌发酵是降低乳清蛋白抗原性的适宜方法。有研究表明，与生乳相比，在经过乳酸菌发酵的灭菌牛乳中，乳清蛋白的抗原性降低了99%以上[22]。Bu 等[23]证实乳清蛋白的抗原性在乳酸菌发酵后显著降低，与未发酵牛乳相比，ALA的抗原抑制率为53%～87%，BLG的抗原抑制率为86%～95%，BLG抗原抑制率高于ALA，这一结果可能是由于一些乳酸菌蛋白酶对BLG的水解能力高于ALA，而且BLG的热稳定性比ALA 差，发酵前的预热处理会导致BLG 构象结构的变性和展开，使得BLG 更容易水解。并且，在降低乳清蛋白的抗原性方面，相较于单独使用，瑞士乳杆菌和嗜热链球菌的联合使用是最有效的，菌株之间的协同效应及机制需要深入研究[23]。

最近，将水解酶与益生菌结合开发新型功能性水解物，使得水解蛋白的应用领域更加广阔。已经证明益生菌在减少过敏患者症状方面的有益作用，将益生菌添加到低致敏配方粉是一种创新的预防和治疗食物过敏的模式[54]。鼠李糖乳杆菌GG（Lactobacillus rhamnosus GG，LGG）是研究最多的益生菌，当添加到eHF 中时有明显的益处，LGG 降低了特应性皮炎的严重程度，减少了肠道炎症，更快地诱导了患有CMPA的婴儿的耐受性，并改善了过敏性结肠炎的恢复[2]。然而，欧洲儿科胃肠病学和营养学会（European Society of Paediatric Gastroenterology and Nutrition，ESPGHAN）认为，这些新型配方粉仍然不完全令人满意，因为配方中添加的益生菌的真正安全性尚未得到充分评估[55]。通过体内外试验继续开展益生菌脱敏机制研究，建立其安全性评价机制是未来重点研究内容。

表1 总结了一些关于非热加工技术处理牛乳过敏原的研究结论。

表1 非热法改性CMPA的研究列表Table 1 List of some studies about modification of CMPA by non-thermal methods

4 部分、深度和完全酶解过敏原水解物在婴儿配方粉中的应用

一些蛋白质的致敏性可以通过蛋白酶的水解来降低。为了充分降低变应原性和超敏性，尝试将牛乳蛋白质水解成小肽和游离氨基酸[60]，开发用于过敏婴儿日常食用的无致敏配方粉或临床用于治疗幼儿过敏的低致敏配方粉。然而，问题是这些水解物往往风味差，有苦味，脂质乳化性低，氨基酸类配方粉增加机体渗透压而且成本高，因此，开发无致敏性的、适口的部分水解配方粉是解决问题的关键所在[61]。

牛乳蛋白部分水解配方粉最早是由雀巢公司（超级能恩）于1985 年推出的[62]。随后，其他品牌适合牛乳过敏婴幼儿食用的配方粉陆续上市，其中有些品牌的部分水解配方粉（partially hydrolyzed formula，pHF）或深度水解配方粉（extensively hydrolysed formula，eHF）仍存在过敏原B 细胞表位，并可引起过敏反应[63]。研究表明，在pHF 和eHF 之间BLG残留量存在很大的差异。pHF的BLG 水平是eHF的40000 倍[64]。然而，目前尚不清楚哪种水解物在抑制过敏和天然婴儿喂养中更可取；与常规配方粉相比，pHF 似乎是更好的替代品[11]。而且，就成本和口味偏好而言，pHF 优于大多数eHF[64]。虽然没有明确的eHF 和pHF的定义，但这两种婴儿配方粉已经开发市售。水解婴儿配方粉由于蛋白质来源、水解程度、蛋白酶种类、辅助加工技术（如热加工）和肽谱不同而有差异，过敏原残留可能仍然存在[11]。配方粉中残留的抗原性取决于在制备过程中应用的水解和过滤技术的程度，因此，建议在CMPA 婴儿饮食中引入水解配方粉之前，应首先确认其安全性[65]。将婴儿配方粉标记为低致敏性的主要标准是:通过双盲试验、安慰剂对照试验确认为90%的CMPA的儿童或婴儿没有表现出过敏反应[66]。

在pHF 和eHF 研究的基础上，发展了完全水解或氨基酸配方粉（amino acid-derived formulas，AAF）。研究表明，使用AAF 可以大大降低致敏反应[12]。建议给eHF 过敏、生长迟缓或多种食物过敏的婴儿补充AAF[12]。AAF 不能广泛地应用的主要问题是高成本和相当不愉快的口味[67]。一些研究中指出，eHFs 和AAFs 是低致敏性的，而pHFs 未列入，因为它所引起的过敏反应是不可预期的[68]。市售部分低致敏配方粉如表2 所示[69]。

表2 市售低致敏配方粉Table 2 Examples of commercially hypoallergenic infant formula

续表 2

5 结论与展望

CMPA 儿童选择替代食品主要取决于两个因素，即营养充足性和无致敏性，除此之外，还要考虑到成本和口味。非热加工技术中的酶水解方法已被广泛应用于低或无致敏配方粉的生产，它具有成本低、条件温和的优点。目前存在的问题是，一些市售牛乳蛋白水解配方粉仍存在致敏性，深度水解配方粉可能会影响非致敏乳蛋白的功能性质，另外，水解处理释放的疏水多肽会产生苦味。因此，为了生产安全、营养、完全无致敏的配方粉，人们对新的非热加工技术寄予厚望。将不同的非热加工工艺结合在一起，例如发酵和动植物源的蛋白酶的结合，可以减少水解物苦味值；高压、微波与酶水解结合，可以使隐性B 细胞作用表位最大程度的暴露并被水解，降低水解物的潜在致敏性。这些新策略的具体效果仍然需要进一步研究，但是一些理论研究数据确实显示了令人满意的结果。近年来，关于益生菌的抗过敏机制研究取得了初步成效，还需要深入分析益生菌的抗过敏调控途径和不同菌株之间的协同效应，建立其在无致敏配方粉中的添加标准。应用非热加工技术，开发营养、完全、无致敏的、适口的婴幼儿配方粉应该作为未来重点研究方向。

另外，尽管目前低或无致敏婴幼儿配方粉的生产以GB25596 为准则，但是仍有一些现实问题需要深入探究，比如，除了过敏原发生了水解，其他功能性乳蛋白也发生了水解，乳蛋白质的生理功能如何保证？乳水解物中的多肽是否具有生物活性，这些生物活性多肽是否具有免疫调节的功能？开发配方粉是基于母乳研究，低或无致敏婴幼儿配方粉的生理功能是否与母乳的生理功能有差异？因此，深入分析低或无致敏婴幼儿配方粉与母乳营养成分、生理功能的差异是未来重点开展的工作，在保证无致敏的同时，也要考虑到水解作用对非致敏乳蛋白质尤其是免疫球蛋白类物质的影响，保障配方粉中非致敏乳蛋白质的生理功能和有效摄入；明确低或无致敏乳蛋白水解物中游离多肽和氨基酸的分布和生理功能，及其与母乳中游离多肽、氨基酸的差异，开发具有母乳化功能的低或无致敏婴幼儿配方粉。