一株产羧酸酯酶菌的鉴定及酯酶特征的研究

张 杰，侯珺淇，代振玉，赵 新，侯小歌

（周口师范学院生命科学与农学学院，河南周口 466001）

中国白酒与西方白酒不同。中国白酒的发酵原料、发酵剂、发酵方式、生产方式、发酵期、发酵设备、蒸馏设备、贮藏设备、贮藏时间和勾兑调味与其他蒸馏酒（西方的威士忌和白兰地）区别较大[1]；中国白酒发酵的独特过程是双边发酵。它通常以酒曲为起曲，在固态条件下发酵。与西方酿造使用麦芽酶不同，酒曲是多种外源微生物产生的酶推动白酒发酵；酒曲不仅决定了白酒发酵的微生物群体及其酶类，而且对白酒风味的形成具有显著的作用，故酒曲发酵剂的独特应用不用于其他白酒[2]；同时糖化和自发发酵过程中淀粉转化为糖及酯类的转化对白酒风味的形成至关重要。固态发酵条件下，微生物的酯化酶产物决定了中国白酒的独特风格[2]。

浓香型白酒中的酯是具有合成和分解的双功能分子。催化酯的合成和分解的酶类即是浓香型白酒发酵产生的羧酸酯酶（酯酶，Esterase）。它是催化浓香型白酒主体香味物质（己酸乙酯）形成的主要酶类。决定白酒风格的重要指标之一就是酯类。因此酶在白酒生产中具有重要地位[3]。红曲酯化菌种参与酒醅发酵后，产出的原酒更具有“窖香突出，幽雅细腻，酒体醇厚，回味悠长”的特点，表明羧酸酯酶产生的己酸乙酯、乳酸乙酯能够改善酒体风格，提高酒的品质[4]。已有研究表明存放4 个月的浓香型白酒大曲总的酯化力达到最高[5]。五粮液大曲中的红曲霉菌株产己酸乙酯酯化酶[6]。中高温大曲中也曾分离出己酸乙酯酯酶活力高达6.7 U/mL的细菌[7]。汾酒大曲中分离到的黑曲霉菌高产己酸乙酯和己酸乙酯的酯化酶[8]。大曲中分离出的芽孢菌的己酸乙酯酯化酶活力达到22.83 U/mL[8]。分析白酒中酯的合成和分解机制，有利于解决白酒中乳酸乙酯含量过高的问题[9−10]。不同香型白酒总大曲酯化酶的催化特性各有特性，且每种酯的合成都有各自的最适酸浓度和pH 值[11−12]。综上所述表明研究对酯化酶产生菌的分离和作用机制的研究对中国白酒的生产具有较高的经济和质量价值。

白酒发酵过程中认识必须基于微生物的分类和鉴定。一般来说，细菌类的鉴定常采用表型、生化和免疫学检测和分子方法[13]。然而，当区分环境相同，密切相关的物种时，这些技术的分辨率很差，往往导致菌株的错误分类和错误识别。多年来，16S rRNA基因被用来描述各种环境中微生物组成。基于16S rRNA 基因测序的分子分析是包括枯草杆菌、地衣菌和贝莱斯芽胞杆菌物种分类鉴定和系统发育树构建的主要工具[14]。然而，16S rRNA 基因序列没有显著性差异物种，因此，用这些检测方法在芽孢杆菌群的鉴定和检测中存在显著的缺陷。这些技术限制已成为阻碍阐明各种食品样品微生物群落的一个重大障碍。在芽孢杆菌菌株的基因组序列中识别特有的基因，进一步鉴定菌株的分类群是特别有效的方法[15]。它在不同环境中识别芽孢杆菌物种时，具有更高保真度、更快和更具成本效益特点的技术。普遍存在的，被认为是安全的，形成内孢子的芽孢杆菌群体之贝莱斯芽胞杆菌（Bacillus velezensis）在食品工业中作为生物资源受到广泛的关注。目前浓香型白酒发酵微生物中的贝莱斯芽胞杆菌的检测、鉴定及其酶学机制尚无报道。

筛选并鉴定酯化酶产生菌并阐述酶特征能为提高大曲品质与白酒的优质品率提供基础。故在本研究中，基于16S rRNA 序列，gyrB和菌株的代谢物基因簇工具鉴定分离出的产酯酶细菌。在此基础之上，研究筛选出的目标菌的生物学和酶学特性，通过分子对接的方法分析酯化酶的分子作用机制。以此指导提高大曲品质和白酒的优质品率，并为揭开中国白酒发酵背后的奥秘提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

高温大曲 宋河酒业有限公司；葡萄糖、蛋白胨、磷酸氢二钾、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钾、硫酸锰、三丁酸甘油酯、琼脂粉、α-萘酚、考马斯亮蓝G250 等试剂 均为国产分析纯。

ZWY-1102C 恒温培养箱 上海智诚分析仪器制造有限公司；2720 thermal cycler PCR Life technologies 公司；TU-1900 双光束紫外可见分光光度计 北京谱析通用仪器有限公司；LDZX-50KBS 高压灭菌锅 上海申安医疗器械厂；Dry 2black 数字金属浴 Thermo Scientific 公司；BX43显微镜 日本奥林帕斯公司。

1.2 实验方法

1.2.2 菌株的鉴定 将菌株划线在三丁酸甘油酯琼脂平板上，在30 °C 下培养48 h，研究菌落形态。取24 h 培养的琼脂平板上的菌体进行革兰氏染色，分析菌体形态。取纯培养的菌落配成菌悬液用作PCR 扩增模板，用通用引物27F（AGAGTTTGATC MTGGCTCAG）和1492R（TACGGYTACCTTGTTA CGACTT）对16S rRNA 基因进行扩增和测序，登录号为（SUB9040179）。gyrB基因的扩增引物为gyrBF（′GAAGTCATCATGACC′）和gyrBR（′AGCAGGG TACGGAT′）。菌株的全基因组序列在NCBI 中的登录号为CP044133。用软件DNAMAN 分析了全基因组核苷酸序列的GC 含量。菌株的代谢物基因簇的预测分析工具为antiSMASH bacterial version（anti-SMASH,https://antismash.secondarymetabolites.org）。

1.2.3 生物信息学分析 根据上述的测序文件，用NCBI 在线blastn 比对，并鉴定分离到的羧酸酯酶分解菌，利用软件MEGA7 软件中Neighbor-joining 法分析其同源关系[12]。根据NCBI 比对出的-羧酸酯酶蛋白序列，利用软件MEGA7 软件中Neighborjoining 法分析-羧酸酯酶氨基酸序列上的同源关系。

根据NCBI 上下载的羧酸酯酶序列采用Multiple Em for Motif Elicitation（http://meme-suite.org/）在线预测其Motif，并用软件TBtools 进一步与同源合并，且可视化[13－14]。

1.2.4 羧酸酯酶提取 将经摇床发酵培养48 h（37 ℃、160 r/min）液体培养基取出，经离心（4 ℃、5000 r/min）20 min 去沉淀，上清液即为粗酶液，置于4 ℃冰箱中保存备用。

1.2.5 酯化酶的蛋白质定量和活性测定 以牛血清白蛋白为校准标准，用Bradford 法测定粗提取的粗酶液浓度。在595 nm 处测定其吸光度。酯化酶活性的分析采用分光光度法[15]。反应条件是将提取的粗酶液，接入到50 mmol/L Tris-HCl pH7.0 缓冲液中，三丁酸甘油酯含量为0.2%，25 ℃ 10 min。然后样品煮沸5 min，用紫外-可见分光度计读取595 nm的吸光度。酯化酶活性的一个单位被定义为在测定条件下每分钟1.0 mg 三丁酸甘油酯所需的酶量。所有实验都做三次重复。

1.2.6 贝莱斯芽胞杆菌的生物学和羧酸酯酶特性

1.2.6.1 贝莱斯芽胞杆菌的生物学 用分光光度计读取560 nm的吸光度为菌体的浓度定量。

1.2.6.2 贝莱斯芽胞杆菌的羧酸酯酶特性 a.金属离子对酯化酶活性的影响：提取的羧酸酯酶接种到包含金属离子或化学试剂的淀粉混合溶液中，金属离子的浓度分别为1 mmoL/L［Ca2+（CaCl2）,Mg2+（MgCl2）,Fe2+（FeCl2）,Na+（NaCl）,K+（KCl）］[11]；酶的活性按照1.2.5 所述的方式测定，并以相对活性的百分比表示，没有任何添加物的反应为空白对照。

老师课前导入本节课的学习目标、重点难点，然后设定龙虎榜（评分表）用以记录每个组的得分，激发学生胜负欲望。接着邀请各组派代表对收集到的产品资料进行介绍，老师在黑板上把学生提及的产品信息点列出来。最后由老师进行划重点和归纳，就形成了产品说明书的基本要素。

b.pH 对酯化酶活性的影响:pH 对酯化酶活性影响的测定范围为pH2.0～10.0的范围，在50 mmol/L不同pH的缓冲液中反应[16]。将酯化酶接入到0.2%的三丁酸甘油酯液体培养基中，25 ℃反应10 min。反应前酯化酶在25 ℃的缓冲液中预热1 h，孵育时，pH 调至7.0。酯化酶活性的计算为消耗三丁酸甘油酯的量相对起始含量的百分比（25 ℃，10 min，pH7.0）。所有实验做三次重复。

1.2.7 羧酸酯酶的分子对接 以16S 100%同源同属同种菌株（Bacillus velezensisFJAT-46737,CP044133）的全基因组为模板，用SWISS-MODEL（https://swissmodel.expasy.org/）在线建模的方式预测-羧酸酯酶的3D 体结构，并下载相应的PDB 文件[17−21]。上述的蛋白序列和羧酸酯酶模型上传到ESPript（http://espript.ibcp.fr/ESPript/cgi-bin/ESPript.cgi）在线分析并生成Aligment 与相应的结构[21]。

根据蛋白质数据库提供的信息（https://www.rcsb.org/），用ChemDraw Professional 17.0（https://www.chemdraw.com.cn/）绘制三磷酸甘油酯（lCID_6050）的配体结构，并用Chem3D 17.0 将三磷酸甘油酯的化学结构转化为pdb 格式的三维结构。用Chem3D 17.0 软件去除-羧酸酯酶的水和不相关的极性原子和配体，获得稳定和有效的受体。在线预测（https://www.d3pharma.com/D3Pocket/index.php）-羧酸酯酶的活性中心[22]。

用Chimera 插件的AutodockVina 预测了配体合与受体的结合模式。分子受体绑定过程、键的作用力和动画生成采用USCF Chimera 1.13.1rc（http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/）软件中的默认参数生成。用PyMOL 软件绘制-羧酸酯酶的三维结构（https://pymol.org/2/）、活性中心和受体与配体作用的氢键[23]。用软件PoseView1.1.2 生成配体与受体催化位点的氢键平面图[24]。

1.3 数据处理

采用IBM SPSS Statistics 19.0 软件用单因素ANOVA 方差分析，P<0.05 为差异显著，P<0.01 为差异极显著，大写字母代表极显著性差异，小写字母代表显著性差异。。

2 结果与分析

2.1 羧酸酯酶产生菌的分离和鉴定

形态学观察结果显示分离的菌株菌落形态为圆形，生长初期表明光滑兼有荚膜，后期菌落表面有褶皱（图1A，B）。革兰氏染色显示为阴性，棒状（图1C）。菌落PCR 扩增出16S rRNA 序列测序结果优良（MW580690），16S rRNA 序列的blastn 结果表明其与贝莱斯芽胞杆菌相似性达到了100%；用16S rRNA 序列构建的系统发育树结果显示其与贝莱斯芽胞杆菌群体处以相同分支（图1D）。同样地，gyr B基因blastn 结果表明其与贝莱斯芽胞杆菌相似性达到了100%；故认为该菌株属于贝莱斯芽胞杆菌家族成员。初步认为该菌株为贝莱斯芽胞杆菌（编号Pb1，MW580690）。

图1 微生物的分离和鉴定结果Fig.1 Isolation and identification of the strain

采用antiSMASH 法分析了该菌株生物活性代谢产物的基因簇。结果表明该菌株具有12 个基因簇，分别负责合脂肽、丁酰苷菌毒素A/B、2 个萜烯族群、硫肽化合物、催乳素H、芬枯草菌素、3 个聚酮合酶类、地非西丁、杆菌肌动蛋白、杆菌溶素（图2A红色方框）。羧酸酯酶（carboxylesterase）处于脂肽基因簇中的其它基因簇中（图2A，B 蓝色方框），并且该簇基因与贝莱斯芽胞杆菌数据库中的其它基因簇的相似率达到了100%（图2C）。这些结果表明Pb1 是具有酯化基因的菌株。

图2 菌株生物活性次生代谢产物基因簇的预测Fig.2 Analysis of the secondary metabolite gene clusters of the strain

2.2 贝莱斯芽胞杆菌羧酸酯酶的蛋白序列分析

根据上述16SrRNA 鉴定结果，以NCBI 蛋白数据库为模板，获得自己菌株的羧酸酯酶；羧酸酯酶氨基酸分析结果显示其同源性大于35%，即表明羧酸酯酶蛋白序列在芽孢杆菌中相对保守（图3A 左）；Motif 分析结果表明本研究与数据库中的羧酸酯酶均含有5 个保守基序，结构相似，且在蛋白序列中的位置保守（图3A 右），本研究的羧酸酯酶前四个Motif的氨基酸序列最为保守（图3B a,b,c,d）。

图3 羧酸酯酶的氨基酸序列同源性和Motif 分析Fig.3 Homology analysis of amino acid se-quences and motif of carboxylesterase

二级结构表明羧酸酯酶有9 个α螺旋，7 个β折叠，1 个稀有的无规则卷曲，其余为环状结构，4 个保守的Motif 位于序列的前端，其可能的催化位点为Phe（图4 绿色方框）。这与羧酸酯酶的同源性结果分析相一致。表明可用该酶的氨基酸序列进一步查询其晶体结构，并进行分子动力学分析。

图4 羧酸酯酶的序列比对和结构分析Fig.4 Analysis of sequence and structure of car-boxylesterase

2.3 贝莱斯芽胞杆菌的生物学和羧酸酯酶特性分析

液体摇瓶培养结果显示该菌在三丁酸甘油酯液体培养基内的生长曲线如图5A 所示，接种后的6～36 h 内是其指数生长期，36 h 后进入平稳期。其产物曲线呈现单“S”型曲线，接种4～24 h 时间段内为指数期，26 h 后蛋白产量进入到平稳期（图5B）；金属离子敏感性实验表明羧酸酯酶活性显著的受Fe2+、Na+、K+和Mg2+限制（图5C）。pH 耐性实验结果显示该酶具有较宽的环境适应性，pH5～ 9的范围内，酶活性不受影响（图5D）。上述结果表明该菌株能在接种26 h 后达到产羧酸酯酶稳定期，能在较宽pH 范围内保持酶的活性，培养时加入合适的金属离子时可以提升发酵液羧酸酯酶活力。

图5 贝莱斯芽胞杆菌的生物学和羧酸酯酶特性Fig.5 Biological and carboxylesterase characteristics analysis of Bacillus velezensis

2.4 贝莱斯芽胞杆菌羧酸酯酶的分子对接

根据其相似的蛋白序列进行了在线建模。建模形成的拉氏图显示其蛋白序列与模板（PDB:6nkg.1）序列的相似性达到88.16，GMQE 值为0.90，QMENA值为−0.01。这些结果表明进入最大允许区（深绿色区域）和允许区（图中浅绿色区域）的氨基酸残基占整个蛋白质的比例为99.7 %，构象处在立体化学允许区，可以稳定存在。建模结果要求与模型获得分值适合于下一步分子对接（表1）。故认为该模型的构象符合立体化学规则（图6A 和B）。故下载该模型的PDB 格式进行分子对接。D3Pockets 预测到该蛋白有6 个活性中心，其相应的参数如表2 所示。

表1 蛋白三维建模评分标准Table 1 Index of score of model building

表2 活性中心预测评分Table 2 Results of active center score

最有可能的活性中是1 和2 层级或两者兼而有之。其中红色区域为构象最稳定的活性中心P2 或P1（图6C）。静电力学分析显示该活性中配体处于一个疏水性为主的空间（图6D）。故以红色区域为中心，执行配体与受体对接，对接结果显示三丁酸甘油酯分子与羧酸酯酶形成了五个构象变化，其中在预测的活性中心P2 处形成的构象评分最为合理（Score=−5.3,RMSD 1.b.=1.446,RMSD u.b.=5.642,表3 所示）。

表3 对接评分结果Table 3 Results of molecular docking score

以最佳构象进行分子动力学模拟发现配体在活性中心以氢键、非配位键和疏水性与受体作用形成了三丁酸甘油酯的稳定构象。主要的配对的氢键及键长信息分别如下：Phe21A<->T 1.C O4:3.20 Å（图6E左）。另外参与非配位键形成疏水作用的受体氨基酸分别为：Pro114（A），Met123（A），Gly126（A），Met191（A），Val120（A），Leu223（A），His219（A），Asp27（A）（图6E 右）。模拟过程发现预测活性中心P1 为配体进入酶活性中心的初始口袋即“界面活化”作用，经过构象变化进入活性中心P2，即是催化三位一体中心；在羧酸酯酶活性中心，Phe 作为氢键能量转化供体与周围的疏水作用力共同作用把三丁酸甘油酯分解为丁酸和甘油（图6E 绿色箭头所指）。

图6 贝莱斯芽胞杆菌羧酸酯酶建模和分子对接Fig.6 Model building and molecular docking of carboxylesterase

3 讨论

以酒曲作为起始发酵剂。酒曲不仅决定了白酒发酵的主要微生物联合体及其酶类，而且对风味形成也至关重要。一般来说，微生物的检测、定量和鉴定常采用表型、生化和免疫学检测和分子生物学的方法。然而，当区分密切相关的物种时，这些技术的分辨率很差，往往导致菌株的错误分类和错误识别[16]。故采用16S rRNA 序列、gyrB基因和完整基因组序列活性代谢产物分析相结合的方法区分这些物种。本研究认定分析出具有羧酸酯酶基因的Pb1 为贝莱斯芽胞杆菌。贝莱斯芽胞杆菌是稻田中植物相关或发酵食品中最常见的杆菌[25]。白酒大曲中的该菌株可能随发酵原料大米或糯米进入了发酵过程。

全基因组比对分析结果表明Pb1 具有羧酸酯酶基因，该基因处于12 个基因簇的其它基因簇中（图2A，B 蓝色方框），且该基因簇与贝莱斯芽胞杆菌数据库中其它基因簇的相似率达到了100 %（图2C）。同源性鉴定、蛋白质功能、结构和相互作用预测、计算机辅助诱变、系统发育分析等是解决生物学问题的好方法[26]。对贝莱斯芽胞杆菌的蛋白数据库的比对获得羧酸酯酶（ASK60660.1）的蛋白序列，并且通过同源比对和Motif 结构分析进一步获得证实（图3）。二级结构分析结果表明羧酸酯酶有9 个α螺旋，7 个β折叠，1 个稀有的无规则卷曲，其余为环状结构，4 个保守的Motif 位于序列的前端，其可能的催化位点为Phe（图4 绿色方框）。羧酸酯酶（ASK 60660.1）的蛋白序列三维建模结果表明模型与模板（PDB:6nkg.1）序列的相似性达到88.16，GMQE 值为0.90，QMENA 值为−0.01。一般建模结果要求[27]与模型获得分值适合于下一步分子对接。

菌株的生物学实验和酶学特性实验表明该菌株的生长曲线呈 “S”型，接种26 h 后，羧酸酯酶产量达到稳定期，培养时需注意合适的金属离子能提高该酶的活性。具有较宽的pH 环境适应性。酒曲中pH 为3.0 时，羧酸酯酶表现为分解作用，pH 为4.5 时，最适合成己酸乙酯[10]；pH 在3.0～6.0 范围内时，羧酸酯酶表现为最适合成乳酸乙酯；羧酸酯酶合成丁酸乙酯的最适pH 为4.5；大曲羧酸酯酶催化合成乙酸乙酯最适pH 为4.5；大曲羧酸酯酶催化合成乳酸乙酯的最适pH 为6.0；丁酸乙酯酶类的最适pH 为4.0～4.5[11]。也有文献报道清香型、浓香型和酱香型大曲催化合成丁酸乙酯的最适pH 分别为4.5、4.0 和3.0[9]。上述结果表明酒曲微生物产生的羧酸酯酶可能是两性分子或多性分子，在不同条件下发挥不同的功能，形成了不同香型的白酒风格。浓香型白酒中的己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯和丁酸乙酯四大酯类的比例是浓香型白酒质量的关键问题之一。丁酸起到丰富酒体的作用，它由生香功能菌丁酸菌产生。白酒中的丁酸乙酯过高会产生酒体不协调，欠爽净。丁酸乙酯是由丁酸菌或己酸菌产生的丁酸与乙醇经生化反应而合成[28]。故本研究推断该菌产生的羧酸酯酶具有平衡酒体中的丁酸和丁酸乙酯的功能，在协调酒体风味时具有重要作用。在丁酸乙酯过多时，将其分解其为丁酸和乙酯。控制pH的同时，适量添加金属离子对于控制乳酸乙酯和乙酸乙酯含量，进而达到生产上达到了“增己降乳”要求[12]。

分子对接研究可以提供配体-蛋白质结合强度以及配体结合模式和机制的重要见解[28]。为了进一步阐明羧酸酯酶在中国白酒中的分子机制而进行了分子对接。事实上，对酶表面先前底物识别和定位的化学理解仍然缺乏，同时对揭示酶的功能也有相当大的兴趣[29]。建模模型和三丁酸甘油酯对接结果显示三丁酸甘油酯经过五次构象变化，经过预测到的两个口袋中心，最后定位到催化三位一体的活性中心。然后底物分子经过Phe21A 提供氢供体催化水解后，从Met115A 到Glu120A（α螺旋4 和β折叠5 结合处，图4、图6）氨基酸所组成的覆盖的疏水性通道转移到酶表面（图7）。这与Lucia 报道的作用方式相一致[30−31]。

图7 羧酸酯酶疏水性通道Fig.7 Hydrophic cave of carboxylesterase

4 结论

本研究证实了一株具有羧酸酯酶功能的芽孢杆菌为贝莱斯芽胞杆菌；该菌株呈现S 型生长曲线，产物曲线也为S 型，羧酸酯酶活化pH 范围是pH5～9。采用分子建模的方法获得了羧酸酯酶的3D 模型。分子动力学模拟发现Phe21A 为该酶的催化活性氨基酸，分解三丁酸甘油酯为丁酸和甘油。总而言之，该菌的羧酸酯酶具有平衡酒体中的丁酸和丁酸乙酯的功能，在协调酒体风味时具有重要作用。在发酵过程中何时促进该菌的增加，何时抑制需要在实践中解决。在增己降乳时如何控制该菌的数量，确保酒体质量也是需要解决的现实问题。