鸦胆子和水飞蓟主要活性成分对苯妥英代谢的抑制作用研究

陈悦悦 刘 勇 陈银楠 李 巍▲

1.扬州大学医学院转化医学研究院，江苏扬州 225009；2.大连理工大学生命科学与药学学院，辽宁盘锦 124221

苯妥英是治疗癫痫持续性发作的重要二线药物[1-2]。其代谢清除主要由人肝微粒体细胞色素P450（cytochrome P450，CYPs）超家族的CYP2C9 和CYP2C19负责，其中CYP2C9 贡献率达90%[3]。苯妥英治疗窗窄，血药浓度易受同服药物影响[3]，尤其在恶性肿瘤合并癫痫的患者中，同服多种药物存在基于对肝微粒体CYPs 抑制而导致苯妥英血药浓度提高，进而引起不良反应发生的风险[4]。鸦胆子油软胶囊和鸦胆子油乳注射液是已上市的应用于肿瘤辅助治疗的中成药[5-6]，其抗肿瘤的主要活性成分是鸦胆子苦醇和鸦胆子素D[7-8]。此外，水飞蓟是国内外多种护肝保健品中的主要活性成分，也是用于治疗抗肿瘤药物导致肝损伤的重要药物之一[9-10]。水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 是其发挥抗氧化、抗纤维化和肝脏保护等作用的重要物质基础[11]。鸦胆子和水飞蓟制剂与苯妥英在癫痫合并肿瘤患者中均存在联合使用的可能，但上述活性成分对人肝微粒体CYPs 催化苯妥英代谢的影响尚无相关报道。本研究使用人肝微粒体体外孵育体系，探讨鸦胆子苦醇、鸦胆子素D、水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对CYPs 催化苯妥英代谢的抑制作用，并为以服用中药为辅助药物治疗的临床恶性肿瘤合并癫痫患者提供参考依据，以避免临床中药-西药相互作用导致的不良反应的发生。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

QTRAP 6500+三重四级杆液相质谱联用仪（美国AB SCIEX 公司）：配有电喷雾离子化源（ESI）和Analyst 1.4.2 数据处理软件；ExionLCTM 超高效液相色谱仪（美国AB SCIEX 公司）：配置四元梯度泵、在线脱气机、自动进样器、柱温箱；VORTEX-2 涡旋振荡器（美国Scientific Industries 公司）；AUY120 电子天平（岛津国际贸易有限公司）；SY-1220 恒温水浴槽（金坛市杰瑞尔电器有限公司）；ThermoStat C 恒温孵育器（美国eppendorf 公司）。

人肝微粒体（批号：201801SUBK）购自上海瑞德肝脏疾病研究有限公司；氯化镁（批号：20150202）购自国药集团化学试剂有限公司；苯妥英（批号：C1512060）、甲酸（批号：H2014333）购自阿拉丁公司；伞形酮（批号：BCCC1923）和5-（4 羟基苯基）-5-苯基乙内酰脲（p-HPPH）（批号：0021309）购自美国Sigma公司；1-氨基苯并三唑（批号：41043）购自Medchem Express 公司；乙腈（批号：20230531）和甲醇（批号：20230331）购自德国Merck 公司；水飞蓟宾A（批号：K1610034）、水飞蓟宾B（批号：CFS201902）购自武汉中标科技有限公司；鸦胆子苦醇（批号：P12J10F79833）、鸦胆子素D（批号：Y08M631）和还原型辅酶Ⅱ（NADPH，批号：B29N8T49218）购自上海源叶公司；纯度均大于98%。其他的试剂均为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 溶液配制 水飞蓟宾A、水飞蓟宾B、鸦胆子苦醇和鸦胆子素D 均用乙腈分别溶解稀释成三种浓度梯度（1.000、5.000 和10.000 mmol/L）的工作液待用。另将水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 用乙腈分别配制成浓度梯度为0.125、0.250、0.500、1.000、2.000、4.000 和8.000 mmol/L 的工作液。CYPs 广泛抑制剂1-氨基苯并三唑（ABT）用乙腈稀释成浓度为5.000 mmol/L 的储备液备用。另使用乙腈配制4.000 mmol/L 的苯妥英工作液，20.000 mmol/L 伞形酮工作液。使用三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCL，100.000 mmol/L，pH=7.4）配制50.000 mmol/L NADPH 工作液，上述溶液均保存于-20°C。蒸馏水配制500.000 mmol/L 的氯化镁工作液，临用临配。

1.2.2 水飞蓟宾A、水飞蓟宾B、鸦胆子苦醇和鸦胆子素D 对人肝微粒体CYPs 催化的苯妥英代谢的抑制作用 鸦胆子苦醇、鸦胆子素D、水飞蓟宾A、水飞蓟宾B 和空白对照（乙腈）中分别加入Tris-HCl 缓冲液（pH 7.4，终浓度为100.000 mmol/L）、人肝微粒体（终浓度为0.100 mg/ml）、苯妥英（终浓度为20.000 μmol/L）和氯化镁（终浓度为5.000 mmol/L），37℃预孵育3 min后，加入NADPH（终浓度为1.000 mmol/L）起始反应，继续孵育40 min 后通过加入200.000 μl 含内标（0.200 μmol/L 的伞形酮）的乙腈终止反应。阳性对照（广泛CYPs 抑制剂：50.000 μmol/L 的ABT）与微粒体反应体系（与上述终浓度相同的Tris-HCl 缓冲液、人肝微粒体、氯化镁和NADPH）预孵育30 min，然后加入苯妥英，孵育40 min 后加入200 μl 含内标的乙腈终止反应。

1.2.3 水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对人肝微粒体CYPs催化的苯妥英代谢抑制的半抑制浓度 （50% inhibiting concentration，IC50） 计算方法 向反应体系（100.000 mmol/L pH 7.4 Tris-HCl 缓冲液，含苯妥英20.000 μmol/L、氯化镁5.000 mmol/L、人肝微粒体0.100 mg/ml）中分别加入水飞蓟宾A 或水飞蓟宾B（0.000、1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 和80.000 μmol/L），预孵育3 min 后起始反应（NADPH 1.000 mmol/L），继续孵育40 min 后加入200 μl 含内标（0.200 μmol/L 的伞形酮）的乙腈终止反应。计算相对于0.000 μmol/L 组的剩余活性百分比。使用Graph-Pad Prism 8.0.1 进行非线性回归，计算水飞蓟宾A 或水飞蓟宾B 对人肝微粒体CYPs 催化的苯妥英代谢抑制的IC50。

1.2.4 色谱条件 使用高效液相色谱和质谱仪测定苯妥英的代谢产物，采用ACQUITY UPLC®C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm）色谱柱分离反应混合物，柱温35℃；采用流动相A（含0.1%甲酸的水）和流动相B（含0.1%甲酸的乙腈）进行线性梯度洗脱。洗脱条件：0～1.5 min，10%流动相B；1.5～3.5 min，70%流动相B；3.5～4.5 min，10%流动相B；流速：0.3 ml/min；进样量：2 μl。

1.2.5 质谱条件 采用电喷雾ESI 离子源，正离子模式扫描，喷雾电压为5500 V，碰撞气为Medium，离子源雾化器为20 psi，加热辅助器为20 psi，气帘气为35 psi，离子传输毛细管温度为450℃。采用多反应监测（multiple-reaction monitoring，MRM）定量p-HPPH 和内标。用于定量的离子及碰撞能量见表1。

表1 苯妥英代谢产物和内标的多反应监测条件

1.3 观察指标

测定苯妥英的代谢产物p-HPPH 与内标峰面积，将两者比值带入标准曲线并计算苯妥英代谢的反应速率。

1.4 统计学方法

实验数据均用GraphPad Prism 8.0.1 处理，实验结果用均数±标准差（±s）表示。使用单因素方差分析（ANOVA）进行统计学分析，以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 标准曲线

选取浓度范围为0.005～2.500 μmol/L 的p-HPPH标准品为横坐标，苯妥英代谢产物与内标的峰面积比为纵坐标，得到标准曲线的线性回归方程Y=22.012X+0.205（r2=0.9994）。

2.2 水飞蓟和鸦胆子主要活性成分苯妥英代谢产物p-HPPH 的抑制作用

鸦胆子苦醇和鸦胆子素D 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L 浓度下的反应速率与0.000 μmol/L比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（图1A、B）。水飞蓟宾A 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L 浓度下苯妥英代谢产物p-HPPH 的生成速率分别为4.360、0.450和0.100 pM/（min·mg）pro，低于0.000 μmol/L时的14.060 pM/（min·mg）pro，差异有统计学意义（P＜0.05）。水飞蓟宾B 在10.000、50.000 和100.000 μmol/L浓度下p-HPPH 的生成速率分别为5.940、0.002 和～0.000 pM/（min·mg）pro，低于0.000 μmol/L 时的12.500 pM/（min·mg）pro，差异有统计学意义（P＜0.05）（图1C、D）。

图1 鸦胆子苦醇、鸦胆子素D、水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 分别在不同浓度时对苯妥英代谢产物p-HPPH 生成速率的影响

2.3 水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对p-HPPH 生成抑制的IC50

为进一步获得水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对人肝微粒体CYPs 催化苯妥英生成p-HPPH 抑制的IC50，分别计算上述两化合物浓度为1.250、2.500、5.000、10.000、20.000、40.000 和80.000 μmol/L 时对苯妥英代谢产物p-HPPH 生成的抑制率。非线性回归获得水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对p-HPPH 生成抑制IC50分别为7.670 μmol/L 和15.490 μmol/L。

3 讨论

苯妥英是临床最常用的抗癫痫药物之一，主要由CYP2C9 代谢。由于其治疗窗窄，且药代动力学曲线呈非线性，因此苯妥英血药浓度的微弱变化均可显著影响其疗效和毒副作用[12]。临床中很多癫痫患者在服用苯妥英治疗的同时也服用了中药作为辅助治疗，因此增加了药物相互作用的风险[13-14]。因而在体外研究苯妥英与中药的具体活性成分的相互作用具有重要的临床意义。本研究探讨鸦胆子苦醇和鸦胆子素D对苯妥英代谢的影响，结果显示鸦胆子苦醇和鸦胆子素D 对苯妥英代谢无明显抑制作用，提示上述化合物与苯妥英共服时可能不会发生基于CYPs 抑制而导致的苯妥英药代动力学性质的改变。目前尚未有研究报道鸦胆子苦醇和鸦胆子素D 在体内主要由何种酶代谢，由此结果可推测催化苯妥英代谢的CYP2C9和CYP2C19 可能在代谢鸦胆子苦醇和鸦胆子素D 中发挥的作用较小。

水飞蓟活性成分制剂在国内常作为保肝处方药使用。此外，国内外也将其作为保健品食用，人们通常认为其安全无副作用，因而忽视药物相互作用造成的影响。目前已有研究和病例报道证实水飞蓟可以抑制CYP2C9 底物甲苯磺丁脲和华法林的代谢[15-17]，但水飞蓟与苯妥英的相互作用并不清楚。本研究探讨水飞蓟的主要成分水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对苯妥英代谢的影响，证实水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 可抑制人肝微粒体CYPs 催化的苯妥英代谢。中药对CYP2C9酶的抑制程度可大致分为强抑制（IC50＜10 μmol/L）、中等抑制（10 μmol/L＜IC50＜50 μmol/L）、弱抑制（IC50＞50 μmol/L）[17]。本研究结果显示，水飞蓟宾A 是p-HPPH生成的强抑制剂（IC50=7.670 μmol/L），水飞蓟宾B 为中等强度抑制剂（IC50=15.490 μmol/L）。与以往水飞蓟宾B 对CYP2C9 底物华法林代谢的抑制作用强于水飞蓟宾A 的结果相反[18]。相关机制仍有待进一步研究。

健康志愿者在服用120 mg 水飞蓟制品后，体内水飞蓟宾浓度最大可达12.5 μmol/L[19]。因此可推测水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 在体内极有可能抑制苯妥英的代谢而引起临床不良反应的发生。但中药由于其复杂性，吸收进入体内的量并不清楚，因此体内和体外的差异性问题仍值得关注。水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B抑制苯妥英的代谢也仍需进一步的临床研究证实其相关性。CYP2C9 和CYP2C19 均具有高度多态性，也是影响苯妥英代谢的主要原因之一[20]。目前已证实携带一个或两个有缺陷的CYP2C9 等位基因的个体在使用常规剂量苯妥英治疗时更易发生中枢神经系统不良反应和严重的皮肤不良反应[21]。本研究仅以人肝微粒体探究了水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 对苯妥英代谢的影响，水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 在CYP2C9 的突变体体系中对苯妥英的影响值得进一步深究。

综上所述，水飞蓟宾A 和水飞蓟宾B 与苯妥英共服时可能通过抑制CYPs 增加体内苯妥英血药浓度，进而引发临床不良反应的风险，对于预测中药-西药相互作用，为指导临床中药-西药合理联用在治疗肿瘤合并癫痫的患者中具有重要意义。