朝药桑黄的质量标准研究

王 辉 王乐奇 杨树东 韩 达 宋爱群

1.长春市食品药品检验中心中药室，吉林长春 130012；2.东北师范大学化学学院，吉林长春 130024；3.长春市食品药品检验中心分析仪器研究室，吉林长春 130012；4.吉林省通化博祥药业股份有限公司项目部，吉林集安 134200

[关键字]朝药桑黄；微波消解-电感耦合等离子体质谱；重金属及有害元素；薄层色谱鉴别；质量标准

桑黄始载于《神农本草经》，《本草经集注》《药性论》《新修本草》和《千金翼方》等古代本草书籍均有收载，历史上“桑黄”药名最早出现在《药性论》[1]。现代《中药大辞典》[2]、朝鲜族医药文献《乡药集成方》[3]等有收载。桑黄传统用于止血活血、化饮、止泻，主治脱肛泻血、崩中带下、瘕积聚、利五脏、伏血等症[2]。桑黄是国际高度关注的食药用菌之一，现代研究证明其具有抗氧化活性，能用于治疗癌症，与癌症化疗药物联用具有增效减毒作用，具有提高机体免疫力、保肝护肝、抗菌消炎等功效[4-6]。

桑黄的记载已有两千多年历史，依据古籍对桑黄性状的描述，经过现代分类学家研究发现，外观相似的真菌多种，确定桑黄非单一来源[7]。收载桑黄的法定标准有《湖北省中药材标准》[8]、甘肃省中藏药材标准[9]、《安徽省中药饮片炮制规范》[10]等，但桑黄药材基源各不同。

桑黄为吉林省朝鲜族习用药材，是吉林省药用菌重要栽培品种，长白山地区“特色药材”。该药材法定标准收载于《吉林省中药材标准》[11]和《吉林省中药饮片炮制规范》[12]。本文采用微波消解-电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）、薄层色谱法和紫外-可见分光光度法，对不同产地桑黄的安全性与质量进行考察，旨在为桑黄质量标准的建立与评价提供依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器

TLC Visualizer 2 薄层色谱数码成像系统（瑞士CAMAG 公司）；MARS6 微波消解仪（美国CEM 公司）；NexION 2000 电感耦合等离子体质谱仪（美国Perkin Elmer 公司）；UV2550 紫外-可见分光光度计（日本岛津公司）；TU-1900 紫外-可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；XS105 电子天平（美国梅特勒公司）。

1.2 试剂及试药

硅胶G 薄层板（青岛海洋化工厂分厂）；甲苯（国药集团化学试剂有限公司）；甲酸（天津市科密欧化学试剂有限公司）；硝酸（Fisher Chemical）；蒽酮（上海麦克林生化科技有限公司）；硫酸（北京化学试剂公司）；亚硝酸钠、乙酸乙酯、硝酸铝、氢氧化钠（均为北京化工厂）；实验用水均为超纯水。

1.3 样本、对照品及对照药材

25 种元素混合标准溶液（批号：19D6230）；汞（Hg，批号：191046-3）；铟（In，批号：193014）；钪（Sc，批号：193021）；铋（Bi，批号：193022-1）；金（Au，批号：191095-2）。以上元素标准溶液来源为国家有色金属及电子材料分析测试中心。D-无水葡萄糖（中国食品药品检定研究院，批号：110833-201707，含量：99.9%）；芦丁（中国食品药品检定研究院，批号：100080-201811，含量：91.7%）；桑黄对照药材[由海南医学院范宇光副教授鉴定，基原为锈革孔菌科瓦宁木层孔菌Sanghuangporus vaninii（Ljub） L.W.Zhou &Y.C.Dai[11]]。

样本来源见表1。

表1 样本来源

2 方法与结果

2.1 方法

2.1.1 薄层色谱法（thin layer chromatography，TLC）鉴别方法

取样本粗粉1.5 g，加甲醇60 ml，超声30 min，滤过，滤液蒸干，残渣加甲醇3 ml 使溶解，作为供试品溶液。另取桑黄对照药材1.5 g，同法制成桑黄对照药材溶液。按照薄层色谱法试验[13]59，吸取样本与桑黄对照药材溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G 薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸（8∶5∶2）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。

2.1.2 微波消解-ICP-MS 测定法

2.1.2.1 对照品的制备

将混合标准溶液用（5%+95%）的硝酸依次按1∶50∶1.667∶3∶2∶5 依次稀释成相应浓度的标准系列溶液，将汞单元素标准溶液用（5%+95%）的硝酸配制成0.1、0.5、1、2、3 μg/L 系列标准溶液，现配现用，将In、Bi、Sc 配制成浓度为100 μg/L 的内标混合溶液。

2.1.2.2 样本的处理

称取样品粗粉0.5 g，置微波消解内罐中，加入7 ml硝酸，用微波消解法消解完全，加入200 μl 浓度为1 μg/ml 的Au 单元素标准溶液，将消解罐放入石墨消解仪上100℃加热30 min，用水定容至50 ml，混匀备用。

除不加Au 单元素标准溶液外，同法制备试剂空白。

2.1.2.3 加样回收率

称取2 号样品6 份，每份0.5 g，分别加入26 种元素标准品，然后按样品操作，测定加样回收率。

2.1.2.4 实验条件

消解仪条件：5 min 由室温升到100℃保持3 min，7 min 由100℃升到150℃保持10 min，7 min 由150℃升到180℃保持20 min。

ICP-MS 条件：射频发生器功率为1600 W，碰撞气为氦气，载气为氩气，雾化气流量为1.04 L/min，驻留时间为50 ms，雾化室温度为2℃，数据采集重复次数为3 次。

2.1.3 桑黄多糖含量测定方法

2.1.3.1 样本的处理

取样本粗粉0.9 g，精密称定，置锥形瓶中，加水100 ml 使样品充分润湿，静置1 h，加热回流4 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，将滤渣及滤纸置锥形瓶中，加水100 ml，加热回流3 h，趁热滤过，用少量热水洗涤滤器和滤渣，合并滤液，置水浴上蒸干，残渣用水10 ml 溶解，边搅拌边缓慢滴加无水乙醇90 ml，摇匀，在4℃放置12 h，离心，弃去上清液，沉淀物用热水溶解并转移至25 ml 量瓶中，放冷，加水至刻度，摇匀，取溶液适量，离心，精密量取上清液5 ml 置50 ml 量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。测定法参照《中华人民共和国药典》（2020年版·一部）灵芝项下[14]195。

2.1.3.2 方法学

2.1.3.2.1 线性与范围 精密称取于105℃干燥至恒重的无水葡萄糖对照品12.01 mg，置100 ml 容量瓶中，加水制成每1 ml 含0.1201 mg 的溶液。标准曲线制备参照《中华人民共和国药典》（2020年版·一部）灵芝项下方法[14]195进行配制并测定，绘制标准曲线。

2.1.3.2.2 精密度试验 ①重复性：取5 号样品粗粉0.45 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共9 份，对照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每个比例制备3 份，按样本处理方法提取测定；②中间精密度：取5 号样品粗粉0.9 g，不同操作人员，不同的紫外-可见分光光度计，不同检测日期，按样本处理方法提取测定，测定桑黄多糖含量。

2.1.3.2.3 准确度试验 取已知含量5 号样品粗粉0.45 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共9 份，对照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每个比例制备3 份，按样本处理方法提取测定，计算加样回收率。

2.1.3.2.4 耐用性试验 ①紫外-可见分光光度计考察：分别采用二个不同品牌的紫外可见分光光度计（岛津UV2550，带宽分别为0.5、1、2 nm，普析通用TU-1900，带宽为2 nm）；②试剂考察：分别采用不同厂家的蒽酮和硫酸，配制硫酸蒽酮溶液，测定同一样品中多糖的含量。

2.1.4 桑黄总黄酮含量测定方法

2.1.4.1 样本的制备

取本品粗粉约0.3 g，精密称定，加60%乙醇60 ml，加热回流提取2 h，放冷，滤过，用60%乙醇35 ml，分次洗涤残渣，合并滤液，置100 ml 量瓶中，用60%乙醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.4.2 对照品溶液的制备精密称取芦丁对照品适量，加60%乙醇适量，制成每l ml 中含芦丁0.2 mg 的溶液，即得。

2.1.4.3 标准曲线的制备

精密量取对照品溶液l、2、3、4、5、6 ml，分别置25 ml 量瓶中，各加水至6 ml，加5%亚硝酸钠溶液1 ml，混匀，放置6 min，加10%硝酸铝溶液l ml，摇匀，放置6 min，加氢氧化钠试液10 ml，再加水至刻度，摇匀，放置15 min。以相应的试剂为空白，通过全波长扫描，确定波长为509 nm，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。

2.1.4.4 精密度试验

①重复性：取5 号样品粗粉0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共9 份，对照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每个比例制备3 份，按样本制备方法提取、测定。②中间精密度：取5 号样品粗粉0.3 g，不同操作人员，不同紫外-可见分光光度计，不同检测日期，按样本制备方法提取，测定。

2.1.4.5 准确度试验

取已知含量5 号样品粗粉0.15 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，共9 份，对照品按1.5∶1、1∶1、0.5∶1 加入，每个比例制备3 份，按样本制备方法提取、测定，计算加样回收率。

2.1.4.6 耐用性试验

紫外-可见分光光度计考察：分别采用二个不同品牌的紫外-可见分光光度计（岛津UV2550，带宽分别为0.5、1、2 nm，普析通用TU-1900，带宽为2 nm），测定样品中总黄酮的含量。

2.2 结果

2.2.1 TLC 鉴别结果

进行耐用性和不同产地样本考察，结果表明，TLC 鉴别的耐用性良好，专属性强，10 批不同产地的样本薄层色谱图见图1，结果显示，其薄层色谱图基本一致，此方法的建立能有效保证桑黄的质量。

图1 TLC 色谱图

2.2.2 ICP-MS 测定结果

26 种元素的标准曲线、r值、线性范围等参数见表2。相应浓度范围内回归方程r值均高于0.995，线性关系良好。平行制备11 个试剂空白，测定试剂空白值，检出限为3 SD。同一样本重复测定7 次，计算仪器精密度，结果良好。加样回收率和r值均符合《中华人民共和国药典》（2020年版·四部）规定[13]482。

表2 桑黄的ICP-MS 方法学参数

10 批桑黄样本的各元素含量检测结果见表3。

表3 桑黄的ICP-MS 检验结果（mg/kg）

2.2.3 桑黄多糖含量测定结果

2.2.3.1 方法学

2.2.3.1.1 线性与范围 无水葡萄糖在0.024～0.120 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。回归方程为：y=0.937 95x+0.133 29，r=0.9982。

2.2.3.1.2 精密度试验 ①重复性：结果平均值为1.43%，RSD=1.6%（n=9），表明该法的重复性良好。②中间精密度：结果平均值为1.42%，RSD=2.9%（n=6）。表明该法的中间精密度良好。

2.2.3.1.3 准确度试验 平均回收率为94.6%，RSD=1.5%（n=9）。

2.2.3.1.4 耐用性试验 ①紫外-可见分光光度计考察：结果显示，不同仪器和带宽对实验结果的影响，无明显差异；②不同试剂的考察：6 种组合配制成的硫酸蒽酮溶液的测定结果平均值为1.44%，RSD=1.8%（n=6）。

2.2.3.2 样本含量

10 批桑黄多糖含量测定结果见表4。

表4 多糖含量测定结果

2.2.4 桑黄总黄酮测定结果

2.2.4.1 方法学

2.2.4.1.1 线性及范围 总黄酮以芦丁计在0.2～1.2 mg范围内与吸光度呈良好的线性关系。回归方程为：y=0.473 61x-0.0112，r=0.9996。

2.2.4.1.2 精密度试验 重复性测定结果平均值为8.77%，RSD=1.4%（n=9），试验表明该法的重复性良好；中间精密度含量测定结果平均值为8.76%，RSD=2.7%（n=6），结果表明该法的中间精密度良好。

2.2.4.1.3 准确度试验 总黄酮平均回收率为96.3%，RSD=1.4%（n=9）。

2.2.4.1.4 耐用性试验 分别采用两个不同品牌的紫外-可见分光光度计测定，测定结果平均值为8.74%，RSD=1.8%（n=4），显示不同仪器和带宽对实验结果的影响，无明显差异。

2.2.4.2 样本含量10 批桑黄总黄酮的含量测定结果见表5。

表5 总黄酮含量测定结果

3 讨论

对薄层色谱鉴别中提取溶剂（甲醇、乙酸乙酯、石油醚）及提取方法（回流提取与超声处理）进行了考察。结果表明提取溶剂为甲醇时，提取成分较多，同时回流提取与超声处理无明显差别，由于超声方法处理简单，重复性与稳定性良好，易于检验，故采用甲醇超声作为桑黄薄层鉴别处理方法。

通过微波消解-电感耦合等离子体质谱法测定10 批不同产地桑黄中26 种元素的含量。结果分析：①铅、镉、砷、汞、铜为《中华人民共和国药典》（2020年版·四部）规定的5 种重金属及有害元素，参照人参项下相关规定[14]8，桑黄样本均未超标。②高含量的5 种有益元素，分别为钾（2772.0～6514.7 mg/kg）、镁（1299.9～1938.2 mg/kg）、钙（523.62～1753.90 mg/kg）、钠（19.886～359.370 mg/kg）和铁（38.469～534.440 mg/kg）。钾元素能维持水分平衡、调节血流量、影响神经传导和对肌肉正常收缩协助等生理作用，对治疗跌打损伤和活血理气有辅助疗效[15]。其中钾元素含量最高，与桑黄的活血、化饮、治瘕积聚、利五脏疗效相符。铁元素参与细胞色素的合成、氧的运输和贮存及提高机体免疫，可能与桑黄提高机体免疫力相关。据报道大运动量的极限或亚极限的力竭训练后，人体钾、镁、钙、钠等元素的流失，会引起运动型心源疲劳[16]。桑黄中钾、钙、钠、镁元素含量高，对其开发改善心脏功能的产品，有重要意义。③锑为高致癌元素[17]、铊元素和钡元素有人体中毒剂量[18-19]，锑元素未检出，铊元素、钡元素含量低，均未超标。锌和硒元素含量较低，剩余11种元素，按每日使用最大剂量30 g[2]计算，摄入量低，同时无桑黄人体中毒报道。26 种元素的检测，目前为止未发现安全风险，为桑黄安全性提供依据。

研究证明,桑黄多糖具有抗肿瘤、改善机体有氧运动、抗氧化和保护造血机能损伤等作用[20-23]，桑黄的总黄酮具有抗癌和抗氧化活性[24-25]，因此建立桑黄多糖与总黄酮检验方法。

本研究同时对10 批不同产地桑黄进行考察，结果重复性与稳定性良好，易于检验，能够为桑黄质量标准的研究与开发提供依据。