褪黑素对年龄相关性黄斑变性模型小鼠视网膜氧化损伤的保护机制研究

董伟华，魏抗抗，帖红艳，何章彪，赵琳

年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration，AMD）是一种与年龄有关的致盲性退行性眼底疾病，随着人口老龄化加剧，发病人数逐年增加［1］。AMD 发病机制复杂，视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium，RPE）变性造成视网膜感受器细胞退化，是导致视觉受损的一个因素，影响RPE 变性的机制可能有炎症、氧化应激和线粒体功能紊乱等［2］。碘酸钠（NaIO3）是强氧化剂，可作为视网膜毒素，造成RPE损伤，因此可用于诱导视网膜病变复制干性AMD。褪黑素（melatonin，MEL）作为抗氧化剂能够清除氧自由基，抑制氧化应激反应，增加抗氧化酶的表达［3］。MEL在视网膜中可以清扫羟基自由基，保护色素上皮免受氧化损伤，但在AMD 中水平降低［4］。目前尚不明确增加MEL的表达能否减轻AMD症状，相关的动物模型研究也较少。沉默信息调节因子1/叉头状转录因子1（silent mating type information regulation 2 homolog 1/forkhead box transcription factor O1，SIRT1/FOXO1）通路具有调控氧化应激作用［5］。MEL可以激活SIRT1/FOXO1通路发挥作用［6］，而MEL在AMD中是否通过影响SIRT1/FOXO1 通路发挥作用目前尚不清楚。本研究通过NaIO3诱导建立 AMD 小鼠模型，探讨MEL 对 AMD的影响及作用机制，为治疗AMD 提供一定参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料 NaIO3粉末（武汉沃弗化工有限公司）；MEL（西安拉维亚生物科技有限公司，CAS登陆号73-31-4，纯度99%）；荧光素钠注射液（广州白云山明兴制药有限公司，国药准字：H44023401）；HE 染色试剂盒（美国Sigma-Aldrich 公司）；超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、过氧化氢酶（CAT）试剂盒，一抗SIRT1（兔源）、FOXO1（兔源）及山羊抗兔二抗均购自英国abcam 公司；一抗Ac-FOXO1（兔源）购自英国Abbkine公司。眼底荧光造影仪（日本ITO公司，型号：TRC-50DX）；蛋白凝胶成像系统（上海Tanon公司，型号：Tanon4600）。

1.2 实验动物 90只SPF级雄性BALB/c小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号：SCXK（京）2016-0011，7 周龄，体质量（20±2）g。饲养条件：温度（23±1）℃、湿度（50±5）%，自然光照，自由饮水饮食。所有实验过程符合3R 原则，本研究经商丘医学高等专科学校动物伦理委员会审核并批准。

1.3 方法

1.3.1 动物造模与分组 实验前所有小鼠经眼科裂隙灯下检查均未发现眼部异常。90 只小鼠按随机数字表法分为正常组，模型组及MEL 低、中、高剂量组，每组18 只。NaIO3粉末用生理盐水溶解，制成20 g/L溶液，4 ℃冰箱暂存。除正常组外的各组小鼠参照文献［7］尾静脉注射25 μL/g NaIO3，注射完成后将小鼠放置安静、洁净、温暖环境中直至苏醒再进行后续实验；正常组小鼠尾静脉注射等体积生理盐水。小鼠苏醒后MEL 低、中、高剂量组分别以10、20、40 mg/kg MEL 灌胃，MEL 溶于生理盐水中配制成固定1 mL 溶液灌胃；正常组、模型组灌胃等体积生理盐水，1次/d，持续1周。

1.3.2 样品收集 实验结束后所有小鼠眼眶静脉取血，多次采血，取300～400 μL。室温静置2 h，1 000 r/min离心10 min，取上清液待用。每组采用随机数字表法抽取6只观察眼底情况；6只摘除眼球，置于4%多聚甲醛中固定保存；剩余6只摘除眼球，分离出视网膜，置于-80 ℃冰箱保存待用。

1.3.3 眼底荧光造影仪检测 小鼠散瞳，10%荧光素钠注射液（2 mL/kg）腹腔注射，待荧光素钠循环至眼底，眼底荧光造影仪对小鼠右眼行荧光素眼底血管造影（FFA）；FFA 检查后行光学相干断层扫描（OCT），再行眼底照相。由两位操作熟练的眼科工作者测量视网膜厚度。

1.3.4 HE染色检测视网膜形态 4%多聚甲醛固定眼球后，经石蜡固定包埋，平行眼轴方向连续切片，厚度5 μm。视网膜切片苏木素染色，蒸馏水冲洗，滴加伊红染液复染。经二甲苯透明，中性树胶封片后，光学显微镜（×200）观察视网膜结构。

1.3.5 眼眶静脉血SOD、GSH-Px、CAT 活性检测 分别在550、405、412 nm 波长处采用试剂盒检测血清中SOD、GSHPx、CAT的光密度（OD）值，计算对应酶活性。

1.3.6 Western blot 检测小鼠视网膜中 SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1 蛋白水平 视网膜中添加蛋白裂解液冰上研磨，10 000 r/min，4 ℃离心20 min，上清为总蛋白。BCA试剂盒测蛋白浓度，每孔上样20 ng，经凝胶电泳分离、PVDF 膜转膜，5% 脱脂奶粉室温封闭 2 h，添加一抗 SIRT1（1∶1 000）、FOXO1（1∶2 000）、Ac-FOXO1（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000），4 ℃孵育过夜；洗膜后添加山羊抗兔二抗（1∶5 000），室温孵育1 h，DAB显色试剂盒避光显色，蛋白凝胶成像系统拍照和定量分析。

1.4 统计学方法 采用GraphPad Prism 8.0软件进行数据分析。计量资料以表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比较行SNK-q检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MEL 对小鼠眼底影响 正常组小鼠视网膜血管自视盘向周围发出均匀的大血管，分支良好且延伸到视网膜周围；模型组视盘消失，血管出现收缩现象，视网膜变白。随着MEL 剂量的升高，逐渐显示出视盘，视网膜恢复。见图1。

2.2 MEL 对小鼠眼底FFA 影响 正常组荧光均匀分布于血管内；模型组血管出现破裂，荧光出现渗漏现象；随着MEL 剂量的升高，荧光渗漏现象逐渐缓解。见图2。

Fig.1 Color photographs of the fundus in 5 groups of mice图1 5组小鼠眼底彩照视网膜情况

Fig.2 FFA inspection results of 5 groups of mice图2 5组小鼠FFA检查结果

2.3 MEL对小鼠视网膜厚度的影响 正常组、模型组、MEL低剂量组、MEL中剂量组、MEL高剂量组视网膜厚度（μm）分别为 310.16±6.46、220.49±8.48、259.65±8.19、268.16±8.33、298.80±8.17，5 组间比较差异有统计学意义（n=6，F=118.196，P＜0.05）。与正常组相比，模型组，MEL 低、中剂量组视网膜厚度降低（P＜0.05）；与模型组相比，MEL 低、中、高剂量组视网膜厚度增加（P＜0.05）；与MEL 低、中剂量组相比，MEL 高剂量组视网膜厚度增加（P＜0.05）。见图3。

2.4 MEL 对小鼠视网膜形态影响 正常组视网膜各层细胞排列整齐且紧密；模型组视网膜各层细胞排列紊乱，外核层排列松散，细胞嵌入内节段/外节段（IS/OS），内核层（INL）细胞变大且松散排列，RPE沉积物量增多，细胞出现空泡状。随着MEL剂量的升高，各层细胞逐渐排列整齐，外核层（ONL）、INL细胞紧密排列，RPE沉积物量减少。见图4。

2.5 MEL 对血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性的影响 与正常组相比，模型组和MEL低、中、高剂量组的血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性降低（P＜0.05）；与模型组相比，MEL 低、中、高剂量组血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）；与MEL 低剂量组相比，MEL 中剂量组血清中 SOD、GSH-Px 活性升高，MEL 高剂量组血清中 SOD、GSH-Px、CAT 活性升高（P＜0.05）；与MEL 中剂量组相比，MEL 高剂量组血清中SOD、GSH-Px 活性升高（P＜0.05），见表1。

2.6 MEL对视网膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平的影响 5组视网膜中FOXO1蛋白差异无统计学意义。与正常组相比，模型组，MEL 低、中剂量组视网膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平降低，MEL高剂量组视网膜中Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平降低（P＜0.05）；与模型组相比，MEL 低剂量组视网膜中SIRT1 蛋白水平升高（P＜0.05），MEL 中、高剂量组视网膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平升高（P＜0.05）；与MEL低、中剂量组相比，MEL高剂量组视网膜中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平升高（P＜0.05）。见表2、图5。

Fig.3 OCT inspection results of 5 groups of mice图3 5组小鼠OCT检查结果

Fig.4 Retinal morphology of 5 groups of mice(HE staining,×200)图4 5组小鼠视网膜形态（HE染色，×200）

Tab.1 Comparison of SOD,GSH-Px and CAT activities in retinal venous blood between the five groups of mice表1 5组小鼠眼眶静脉血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性比较 （n=18，U/mL，）

Tab.1 Comparison of SOD,GSH-Px and CAT activities in retinal venous blood between the five groups of mice表1 5组小鼠眼眶静脉血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性比较 （n=18，U/mL，）

＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与模型组比较，c与MEL 低剂量组比较，d与MEL中剂量组比较，P＜0.05

组别正常组模型组MEL低剂量组MEL中剂量组MEL高剂量组F SOD 56.42±5.15 26.37±3.42a 31.58±4.16ab 36.72±4.36abc 51.16±5.02abcd 149.026＊＊GSH-Px 156.85±8.18 75.49±6.47a 102.68±7.10ab 134.12±6.78abc 149.55±7.33abcd 403.428＊＊CAT 10.38±1.85 3.96±0.79a 5.46±0.89ab 6.58±0.52ab 7.18±0.86abc 87.834＊＊

Tab.2 Comparison of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in the retina between the 5 groups of mice表2 5组视网膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平比较 （n=6，）

Tab.2 Comparison of SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in the retina between the 5 groups of mice表2 5组视网膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平比较 （n=6，）

＊＊P＜0.01；a与正常组比较，b与模型组比较，c与MEL 低剂量组比较，d与MEL中剂量组比较，P＜0.05

组别正常组模型组MEL低剂量组MEL中剂量组MEL高剂量组F SIRT1 0.21±0.02 0.05±0.01a 0.12±0.02ab 0.14±0.02ab 0.23±0.03bcd 71.591＊＊FOXO1 0.68±0.08 0.59±0.05 0.61±0.09 0.63±0.10 0.68±0.05 1.698 Ac-FOXO1/FOXO1 1.24±0.11 0.12±0.02a 0.19±0.02a 0.23±0.03ab 0.58±0.04abcd 420.526＊＊

Fig.5 SIRT1,FOXO1 and Ac-FOXO1 protein levels in retina of 5 groups of mice图5 5组视网膜中SIRT1、FOXO1、Ac-FOXO1蛋白水平

3 讨论

AMD 最大的危害是导致黄斑中心区视力永久性丧失，已成为中国50岁以上人群眼科疾病的第二病种［8］。湿性AMD 与异常的脉络膜新生血管有关，目前常用治疗方法为玻璃体内注射血管内皮生长因子抗体，通过抑制血管新生达到治疗目的，且效果较好。干性AMD 主要表现为RPE 被大量破坏造成的视损伤，而RPE对于维持血-视网膜屏障、参与视循环、吞噬脱落细胞等都具有重要作用［9］。RPE 破坏可造成炎症反应和氧化应激加剧。NaIO3可特异性作用于RPE，导致RPE 屏障和光感受器细胞功能遭到破坏，从而引起视网膜感光细胞、脉络膜出现病变，造成视网膜损伤，因此减轻氧化损伤对于疾病治疗意义重大［10］。MEL 是脊椎动物松果体的主要分泌物，作为吲哚胺类激素，可起抗氧化、抗凋亡作用［11］，能够清除活性氧自由基，实现对氧化损伤的保护，临床上可用于治疗黄斑变性、青光眼、高血压、糖尿病等［12］，但在AMD中应用缺乏相关研究。本研究发现，模型组中出现视盘消失、视网膜变白，血管收缩，部分血管出现破裂，视网膜各层细胞排列紊乱、RPE层沉积物量增多，细胞出现空泡状，视网膜损伤严重。MEL 治疗后小鼠视盘出现、血管破裂现象好转，视网膜各层次结构逐渐整齐，且视网膜血管收缩、破裂、视网膜厚度降低现象随着MEL 剂量的升高逐渐好转，但其作用机制尚需进一步研究。

SOD 作为自由基清除剂，在机体自由基的产生和清除中发挥重要作用；GSH-Px作为催化过氧化氢分解的酶，其水平与氧化损伤、神经变性等关系密切；CAT作为机体抗氧化系统重要酶，其含量可以评价机体抗氧化能力，三者均作为自由基清除剂在机体发挥作用［13-15］。有研究表明，MEL可以升高SOD、GSH-Px、CAT，降低丙二醛（MDA）水平，从而降低活性氧、减轻氧化应激，保护低温保存的卵巢组织［16］。本研究中模型组眼眶静脉血血清中SOD、GSH-Px、CAT活性较正常组降低，提示AMD视网膜处机体清除自由基能力降低，可能造成氧自由基堆积，损伤细胞和组织；MEL 治疗后眼眶静脉血血清中SOD、GSH-Px、CAT 活性升高，提示 MEL 可以增强机体自由基清除能力，实现对氧化损伤的保护。

SIRT1作为腺嘌呤二核苷酸依赖性蛋白脱乙酰酶，可以通过乙酰化组蛋白修饰赖氨酸残基，FOXO1可以与SIRT1 启动子区域结合位点直接结合，激活SIRT1，又可通过SIRT1 介导发挥抗氧化、抗炎等作用［17］。上调 SIRT1 的 mRNA 和蛋白表达并抑制FOXO1、FOXO3和FOXO4的mRNA和蛋白表达可预防心肌细胞凋亡［18］。上调SIRT1可以提高高糖条件下足细胞SOD、CAT、GSH-Px活性，减少细胞中活性氧水平及足细胞凋亡，其机制与减轻氧化损伤有关［19］。MEL通过以受体依赖的方式激活SIRT1信号传导而减轻氧化应激和血管平滑肌细胞损伤，发挥对胸主动脉瘤和夹层的治疗作用［20］。本研究中，模型组视网膜组织中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1 蛋白水平较正常组降低，提示AMD可抑制SIRT1/FOXO1通路，使该通路发挥抗氧化、抗炎作用降低，导致自由基积累，加重氧化损伤，经MEL治疗后，视网膜组织中SIRT1、Ac-FOXO1/FOXO1蛋白水平升高，提示MEL 可以激活SIRT1/FOXO1 通路，从而提高SOD、GSH-Px、CAT活性，增加氧自由基的清除能力，减轻氧化损伤。

综上所述，MEL 可能通过激活SIRT1/FOXO1 通路实现对AMD 视网膜氧化损伤的保护。本文在动物模型上验证了MEL对AMD的治疗作用，可为临床上AMD的治疗提供一定参考依据，但SIRT1/FOXO1通路与MEL之间的具体调控位点尚需进一步验证。