HPLC法同时测定五指柑中9种成分

陈 丹， 戚建中， 李 柯， 沈冰冰， 符国成， 唐湘黔， 龚小兵

[1.湖南省中医药研究院，湖南 长沙 410013；2.湘潭医卫职业技术学院，湖南 湘潭 411102；3.华润三九(郴州)制药有限公司，湖南 郴州 423000]

五指柑为马鞭草科植物黄荆VitexnegundoLinnaeus 的干燥全草，收载于湖南省中药材标准(2009版)和广东省中药材标准第三册(2019)，功效解表清热、利湿除痰、止咳平喘[1-2]，所含的咖啡酰奎尼酸类和黄酮类成分具有抗炎、抗氧化、抗菌、抗病毒、止咳平喘、保肝等活性。咖啡酰奎尼酸类结构相似，同分异构化合物较多，现有文献定量指标少，只对个别黄酮或总黄酮化合物进行测定，大多采用有机溶剂进行提取，未对有机酸建立定量分析方法[3-5]。目前，以五指柑作为主要原料组成的多个成方制剂都是以水煎液用药，故水提液中所含成分才是其临床主要有效物质[6-9]。本实验以对照药材及不同产地的五指柑为对象，建立了HPLC法同时测定水提液中黄酮类及有机酸类9种成分的含量，该方法稳定可靠，重复性好，可为五指柑药材及相关制剂的质量控制提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 LC-20AT高效液相色谱仪、SPD-20A紫外检测器(日本岛津公司)；XPE105电子分析天平(十万分之一，瑞士Mettler-Toledo公司)；HX-06超声波清洗器(武汉恒信世纪科技有限公司)。

1.2 试剂与药物 绿原酸(批号110753-201716，纯度99.3%)、咖啡酸(批号110885-200102，纯度100%)对照品购自中国食品药品检定研究院；异荭草苷(批号DST180717-121，纯度99%)、荭草苷(批号DST170717-049，纯度99%)、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷(批号DST180715-067，纯度98%)对照品购自成都德思特生物技术有限公司；异牡荆素(批号Yz102220，纯度98%)对照品购自南京源植生物科技有限公司；木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷(批号PRF10022043，纯度98%)对照品购自成都普瑞法科技开发有限公司；新绿原酸(批号MUST-18031001，纯度99.67%)、隐绿原酸(批号MUST-18032403，纯度99.07%)对照品均购自成都曼思特生物科技有限公司。乙腈为色谱纯(购自美国Tedia公司)；磷酸为色谱纯，甲醇为分析纯(长沙市汇虹化玻仪器设备有限公司)；水为怡宝纯净水。五指柑对照药材(批号121496-201502)购自中国食品药品检定研究院；10批五指柑原药材(WZG)均为产地收集(2018年7～8月)，经湖南省中医药研究院李若存研究员鉴定为马鞭草科植物黄荆VitexnegundoLinnaeus 的干燥全草，具体信息见表1。

表1 样品信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件 月旭ultimate C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.5%磷酸(B)，梯度洗脱，程序见表2；检测波长340 nm；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；进样量10 μL。在该色谱条件下，理论板数以各色谱峰计均不少于4 000。

表2 梯度洗脱程序

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 精密称取9种对照品，加50%甲醇制成每1 mL分别含新绿原酸0.104 1 mg、绿原酸0.114 8 mg、隐绿原酸0.124 0 mg、咖啡酸0.101 6 mg、异荭草苷0.465 6 mg、荭草苷0.217 8 mg、异牡荆素0.228 2 mg、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷0.179 2 mg、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷1.019 2 mg的贮备液。

分别精密量取上述贮备液1 mL，置10 mL量瓶中，加50%甲醇制成每1 mL分别含新绿原酸10.41 μg、绿原酸11.48 μg、隐绿原酸12.40 μg、咖啡酸10.16 μg、异荭草苷46.56 μg、荭草苷21.78 μg、异牡荆素22.82 μg、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷17.92 μg、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷101.92 μg的对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取原药材粉末(批号180401)约2.0 g，精密称定，置圆底烧瓶中，加30 mL水加热回流30 min，滤过，药渣再加20 mL水加热回流20 min，滤过，合并2次滤液，蒸干，残渣用60%甲醇溶解并定容至10 mL，0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.2.3 专属性试验 精密吸取对照品、供试品、空白溶液各10 μL，在“2.1”项色谱条件下测定，色谱图见图1。

1.新绿原酸 2.绿原酸 3.隐绿原酸 4.咖啡酸 5.异荭草苷 6.荭草苷 7.异牡荆素 8.木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷 9.木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷

2.3 线性关系考察 分别精密吸取“2.2.1”项下贮备液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mL，按质量浓度由低至高的次序加至6个10 mL量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，分别精密吸取10 μL，在“2.1”项色谱条件下进样测定。以对照品溶液质量浓度为横坐标(X)、峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表3，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

2.4 精密度试验 取对照品溶液，在“2.1”项色谱条件下连续进样6次，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷峰面积RSD分别为1.23%、1.19%、1.48%、0.91%、0.93%、0.62%、0.83%、1.36%、1.27%，表明仪器精密度良好。

2.5 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号180401)，于0、4、8、12、24 h在“2.1”项色谱条件下进样测定，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷峰面积RSD分别为0.23%、0.89%、1.32%、0.34%、1.25%、0.74%、0.68%、1.51%、1.64%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.6 重复性试验 取同一批样品(批号180401)适量，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液6份，在“2.1”项色谱条件下进样，测得新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷含量RSD分别为1.50%、1.59%、1.43%、1.21%、1.63%、1.65%、1.87%、1.54%、1.48%，表明该方法重复性良好。

2.7 加样回收率试验 精密称取同一批各成分含量已知的样品(批号180401)6份，分别加入与供试品溶液中9种成分含量比例约为1∶1的对照品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样，计算回收率。结果，新绿原酸、绿原酸、隐绿原酸、咖啡酸、异荭草苷、荭草苷、异牡荆素、木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷平均加样回收率分别为97.70%、98.39%、97.94%、98.05%、97.80%、97.72%、98.01%、97.21%、97.99%，RSD分别为1.25%、1.90%、2.10%、1.98%、1.70%、1.78%、1.47%、1.67%、1.32%。

2.8 样品含量测定 取10批样品，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下进样测定，计算含量，结果见表4。

表4 各成分含量测定结果(mg/g)

3 讨论

五指柑含黄酮和酚酸，均是抗炎、抗病毒的重要成分[2-4]。有文献报道，以单一黄酮类成分作为五指柑的质控指标[4]；本研究对五指柑中9种成分进行测定，结果不同产地含量差异显著，可能由于产地、加工方法等导致其内在质量出现差异，因此对五指柑多种成分同时测定可更全面反映其内在质量。课题组前期对五指柑进行薄层分析及含量测定[10]，结合9种成分的性质及用药习惯，确定供试品溶液的制备方法为水加热回流提取2次。

取一定质量浓度的9种对照品溶液进行光谱扫描，结果有机酸类成分最大吸收波长为327 nm，荭草苷、异荭草苷、异牡荆素最大吸收波长为340 nm，木犀草素-7-O-葡萄糖醛酸苷、木犀草素-3′-葡萄糖醛酸苷最大吸收波长为348 nm，基本符合文献[有机酸类成分为(327±2)nm[11]，荭草苷、异荭草苷、异牡荆素为330、340或350 nm[12-15]，木犀草素类成分为340或350 nm[16]]。本实验分别在330、340、350 nm波长处对9种成分进行测定，结果各波长对其含量、色谱峰数量均无明显影响，即330～350 nm均可。再比较了乙腈-0.1%甲酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.5%磷酸流动相，发现以乙腈-0.5%磷酸梯度洗脱时9种成分均能达到基线分离。