栀子抗肝内胆汁淤积有效部位筛选及其化学成分研究

付小梅， 王 芳， 刘 婧， 黄 潇， 杨 超， 高 莎， 刘德鸿， 吴志瑰， 裴建国

(江西中医药大学药学院，江西 南昌 330004)

肝内胆汁淤积是由于肝细胞或胆管的胆汁合成、转运或流动障碍，使胆汁无法顺利流入十二指肠，从而导致胆汁酸在肝脏内蓄积，最终引发肝脏病变的临床综合征[1]。熊去氧胆酸、S-腺苷蛋氨酸、糖皮质激素等是目前临床上常选用的治疗该疾病的主要药物，然而这些药物均存在疗效慢、价格贵、长期服用后出现严重的不良反应等弊端，因此研究毒副作用小、起效快的抗肝内胆汁淤积的化学及天然药物迫在眉睫。

栀子来源于茜草科栀子GardeniajasminoidesEllis的干燥成熟果实，在江西称为“小红栀”，是江西著名的道地药材“三子一壳”之一，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的功效，长久以来用于中医临床的保肝利胆药。前期药理研究表明栀子具有良好的利胆保肝效果，同时含有栀子的复方对肝内胆汁淤积性肝损伤也具有良好的防治作用[2-5]，然而有关其治疗肝内胆汁淤积物质却未见报道。因此本实验采用α-萘异硫氰酸酯(α-naphthylisothiocyanate，ANIT) 诱导急性肝内胆汁淤积大鼠，对栀子醇提物不同洗脱部位进行了药效学研究，筛选出栀子抗肝内胆汁淤积有效部位，并应用UPLC-LTQ-Orbitrap技术对各有效部位的物质基础进行了鉴定分析，明确主要的活性成分，为栀子对SD大鼠肝内胆汁淤积的作用机制研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 仪器 LTQ-Oribitrap XL线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱仪(美国Thermo Scientific公司)；Agilent 1260 型高效液相色谱仪(美国安捷伦公司)；Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色谱系统(美国Thermo Scientific公司)；1510型全波长酶标仪(美国Thermo Fisher Sicentific公司)；VCX150超声破碎仪(美国Sonics & Materials公司)；JW-3021 HR型高速冷冻离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；Forma -86C ULT超低温冰箱(美国Thermo electron 公司)；HYD-205型-20 ℃低温冰箱(海尔集团公司)；Y2D-Ⅱ型水平摇床(江苏天翎仪器有限公司)。

1.2 药材与试剂 栀子收集于江西省新干县栀子GAP基地，经江西中医药大学付小梅教授鉴定为栀子GardeniajasminoidesEllis的果实，标本存于江西中医药大学中药鉴定教研室，按2020年版《中国药典》方法进行干燥，备用。京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ对照品均为自制，纯度均大于98%。熊去氧胆酸片(上海信宜药厂有限公司，批号41140501)。α-萘异硫氰酸酯(中国阿拉丁试剂公司，批号K1424065)；总胆汁酸(TBA，批号20170214)、总胆红素(TBIL，批号20170115)、直接胆红素(DBIL，批号20170323)、谷丙转氨酶(ALT，批号20170323)均购于南京建成生物工程研究所。甲醇、乙腈(西陇化工有限公司，色谱纯)。

1.3 动物 SD大鼠，体质量200～220 g，雄性，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产合格证号SCXK2019-0004。饲养环境温度24～26 ℃，相对湿度60%～70%，自由饮食。

2 方法和结果

2.1 样品制备

2.1.1 栀子有效部位的制备 称取药材1.5 kg，粉碎，过2号筛，置20 L圆底烧瓶中，加入70%乙醇15 L回流2 h，抽滤，再加入70%乙醇12 L回流2 h，抽滤，合并两次滤液，40 ℃减压回收乙醇后冷冻干燥，得栀子总提取物干浸膏共359.14 g。取250 g栀子总提取物干浸膏，加1 L水制成混悬液，上HPD-600型大孔树脂，依次用8倍量水、8倍量30%乙醇、8倍量70%乙醇、8倍量95%乙醇洗脱，得到4个洗脱部位，分别减压浓缩后冷冻干燥，分别得水部位77.73 g、30%乙醇洗脱部位71.22 g、70%乙醇洗脱部位48.21 g、95%乙醇洗脱部位17.75 g，备用。

2.1.2 栀子4个有效部位中5种主要成分含量测定

2.1.2.1 供试品溶液制备 分别取上述4个洗脱部位粉末约50 mg，精密称定，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇制成0.5 mg/mL样品溶液，0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.1.2.2 对照品溶液 精密称取对照品(京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷、京尼平苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花苷-Ⅲ)适量，加甲醇制成对照品溶液。

2.1.2.3 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相乙腈(A)-0.2%磷酸(B)；梯度洗脱(0～10 min，6%A；10～18 min，6%～12%A；18～22 min，12%～16%A；22～28 min，16%～20%A；28～40 min，20%A；40～60 min，20%～36%A；60～65 min，36%～55%A)；柱温30 ℃；体积流量1.0 mL/min；检测波长230、440 nm；进样量5 μL。

2.1.2.4 线性关系考察 将对照品按不同比例稀释，在“2.1.2.3”项色谱条件下进样测定。以各成分质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，结果见表1，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表1 5种成分线性关系

2.1.2.5 方法学考察 分别取上述对照品溶液或供试品溶液，进行精密度、稳定性、重复性、加样回收率试验，发现RSD均<3.0%，符合HPLC分析要求。色谱图见图1，含量测定结果见表2。

1.京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷 2.京尼平苷 3.西红花苷-Ⅰ 4.西红花苷-Ⅱ 5.西红花苷-Ⅲ

表2 各成分含量测定结果

2.2 有效部位筛选

2.2.1 造模及给药 将56只SD大鼠随机分为空白组组(0.5%CMC-Na溶液)、模型组(0.5%CMC-Na溶液)、阳性药组(100 mg/kg熊去氧胆酸)、水洗脱部位组(4 g生药/kg)、30%乙醇洗脱部位组(4 g生药/kg)、70%乙醇洗脱部位组(6 g生药/kg)、95%乙醇洗脱部位组(4 g生药/kg)，每组8只。阳性药组及各洗脱部位组均用0.5%CMC-Na溶液溶解，ANIT用橄榄油溶解。各组均连续灌胃给药7 d，在第5天给药后2 h，空白组灌胃给予65 mg/kg橄榄油，其他各组均一次性灌胃给予65 mg/kg ANIT进行造模，结束后继续给药。

表3显示，与空白组比较，模型组大鼠在0～120 min内各时间段的胆汁流量均降低(P<0.01)；与模型组比较，不同洗脱部位均能在各个时间点不同程度增加胆汁量(P<0.05，P<0.01)，其中30%乙醇洗脱部位组程度最大，表明该部位可显著恢复ANIT诱发的肝内胆汁淤积大鼠的胆汁流量。

表3 栀子不同洗脱部位对ANIT致胆汁淤积大鼠胆汁流量的影响[μL·(min·100 g)-1]

2.2.3 血清中TBIL、DBIL、TBA、ALT测定 胆汁收集完成后，腹主动脉取血，全血4 ℃离心5 000 r/min离心10 min，置于4 ℃冰箱中备用。取血后处死大鼠，快速取肝脏，用预冷的PBS冲洗干净后10%甲醛溶液固定，备用。根据TBIL、DBIL、TBA和ALT检测试剂盒说明书，采用全波长酶标仪，测定血清中各指标水平，结果见表4。与空白组比较，模型组血清中DBIL、TBIL、TBA水平升高，表明经过ANIT诱导之后，大鼠发生急性胆汁淤积，胆汁酸不能外排，只能返回入血，同时引起肝内敏感性ALT的活性增加(P<0.01)，表明大鼠的肝功能出现了异常。与模型组比较，栀子30%乙醇洗脱部位组的TBIL及ALT水平降低(P<0.01)，DBIL与TBA水平降低(P<0.05)；栀子70%与95%乙醇洗脱部位组的TBIL与TBA水平降低(P<0.05)，表明栀子30%乙醇洗脱部位组的作用最优。

表4 栀子不同洗脱部位对ANIT致胆汁淤积大鼠血清DBIL、TBIL、TBA、ALT水平的影响

2.2.4 肝组织病理学检测 将已固定的大鼠肝脏取出，经乙醇脱水、浸蜡、石蜡包埋、切片、粘片、HE染色后，用显微镜观察肝组织形态学变化，见图2。空白组大鼠肝细胞排列整齐，无炎症细胞渗出，肝小叶结构清楚，染色体质丰富，肝细胞排列成条索状，肝血窦清晰；模型组肝细胞肿大，有的可见明显点状或灶性坏死，大量炎细胞浸润，肝血窦扩张，可见红细胞；与模型组比较，30%乙醇洗脱部位组小叶结构均较清楚，肝细胞排列较整齐，肝血窦稍扩张，炎细胞浸润减少，表明该部位显著改善ANIT导致的病理损伤。根据上述结果可知，对于改善肝内胆汁淤积而言，栀子30%乙醇洗脱部位药效最好。

注：A为空白组，B为模型组，C为阳性药组，D为栀子水部位组，E为栀子30%乙醇部位组，F为栀子70%组乙醇部位组，G为栀子95%乙醇部位组。

2.3 UPLC-LTQ-Orbitrap分析鉴定栀子30%乙醇洗脱部位化学成分

2.3.1 供试品溶液制备 取栀子30%乙醇洗脱部位粉末约10 mg，置具塞锥形瓶中，加10 mL甲醇超声溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.3.2 分析条件 YMC-UltraHT Pro C18色谱柱(2.0 mm×100 mm，2 μm)；流动相0.1%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脱(0～10 min，5%～15%B；10～12 min，15～20%B；12～20 min，20%～50%B)；体积流量0.3 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。电喷雾离子源(ESI)，负离子扫描；离子源温度300 ℃；鞘气体积流量35 psi(1 psi=6.89 kPa)；辅助气10 psi；喷雾电压3.60 kV；毛细管温度320 ℃；扫描范围m/z300～1 000。

2.3.3 化学成分分析 运用MassLynx V4.1对正负两种离子模式下总离子流图进行分析处理，将各色谱峰的紫外吸收光谱图，一级质谱提供的相对分子质量和二级质谱提供的离子信息与对照品质谱数据及文献报道进行比较，对栀子30%乙醇洗脱部位化学成分进行识别鉴定，共鉴定出了12个化合物，11个为环烯醚萜苷类[6-7]，结果见图3、表5。

10. 京尼平-1-β-D-龙胆双糖苷 11. 京尼平苷

表5 栀子30%乙醇洗脱部位化学成分

3 讨论

肝内胆汁淤积症是内科临床上的常见综合症，目前治疗方式主要是以胆道疏通、胆汁引流和药物治疗为主。ANIT是诱导啮齿类动物肝损伤建立肝内胆汁淤积动物模型的常用药物[8-9]，本实验采用了ANIT诱导的胆汁淤积模型进行栀子抗肝内胆汁淤积有效部位的筛选及药效评价。

ANIT导致肝内胆汁淤积的主要机制是与肝细胞膜发生脂质过氧化反应，致使肝细胞变性、坏死，可能导致胆管上皮细胞肿胀、坏死，引起炎症及胆管阻塞，形成肝内胆汁淤积，其诱发的肝损伤呈现的生化指标和病理改变与人体相似[10]。当肝内胆汁淤积症发生后，胆道排泄系统受到极大影响，依赖该系统进行的胆汁和肝功能酶的正常排泄受阻，肝内胆红素和胆汁酸浓度将急剧升高，逆流入血液；另外，肝细胞及胆管的炎症，肝细胞变性坏死或细胞膜通透性增加，使肝功能酶ALT将渗入血液中，导致胆汁淤积后血清中ALT水平增加，故常通过检测血清内胆汁酸、总胆红素及肝功能酶的活性来初步预测肝内胆汁淤积治疗情况[11-14]。本研究表明栀子30%乙醇洗脱部位改善肝内胆汁淤积的作用最为显著，该部位不仅可以恢复肝内胆汁淤积大鼠的胆汁流量，降低血清中TBIL、DBIL、TBA、ALT的水平；肝组织病理形态结果进一步证实了该部位在一定程度上减少胆汁淤积所致的肝细胞变性坏死，降低肝损伤程度，对ANIT导致肝损伤具有缓解作用，因此该部位为栀子抗肝内胆汁淤积有效部位。

为了进一步确定栀子30%乙醇洗脱部位的化学成分，明确栀子治疗肝内胆汁淤积的物质基础，本实验采用UPLC-LTQ-Orbitrap技术对该部分进行了分析鉴定，共鉴定出12个化合物，其中化合物4京尼平苷酸和化合物7京尼平苷均已被证明具有治疗肝内胆汁淤积症的作用[11，15-16]，而该部位中其它单体成分是否具有治疗作用，成分与成分之间是否有相互作用将进一步深入研究。