基于数据挖掘和网络药理学研究培土生金法治疗肺癌的组方规律及分子机制

王小龙

(阜阳市中医医院药剂科，安徽 阜阳 236000)

国家癌症中心数据显示，2015年我国新增癌症患者392.9万，并有233.8万人死亡，其中肺癌发病和死亡人数均居恶性肿瘤第1位，它是我国最常见的癌症，也是导致癌症死亡的首要原因[1-2]。中医并无“肺癌”病名，相关论述多散见于历代关于“肺积”“息贲”“咳嗽”“咯血”“痞癖”“胸痛”“癥瘕积聚”等记载[3]，对肺癌的认识较早，相关治则治法亦有多种，以“母病及子”“脾虚痰聚于肺”为理论的培土生金法在治疗肺癌方面具有一定的特色和优势。本研究借助TCMISS平台及网络药理学相关数据库，从阜阳市中医医院处方切入，筛选治疗肺癌的新处方，并分析培土生金法治疗肺癌的组方规律及分子机制，阐释中医药治法理论内涵，并为临床用药提供参考。

1 资料与方法

1.1 处方来源 2019年度阜阳市中医医院中药房诊断为肺癌、肺恶性肿瘤个人史的门诊中药处方，经筛选后共纳入86张，均由阜阳市中医医院门诊部、国医堂专家开具，具有一定的代表性。

1.2 数据预处理 由于历史演变、各地习惯等因素，导致中药名称混乱，同药异名、同名异药现象普遍存在，给临床及科研工作带来诸多不便[4]。为便于统计，降低分析结果的偏差，本研究参考2015版《中国药典》[5]、高等院校《中药学》[6]教科书(作为药物一级和二级功效、性味、归经分类的文献依据)《常用中药别名速查手册》[7]，对药名进行规范化处理，其余保证药名一致即可，中药拉丁名参考《中药鉴定学》[8]教材及南京中医药大学中药标本中心(Chinese medicine specimen center of Nanjing University of Chinese Medicine，http://zybb.njucm.edu.cn/)进行规范。

1.3 数据挖掘研究及新处方筛选 将86张处方中的药物逐一录入中医传承辅助平台(TCMISS-V2.5，Traditional Chinese medicine inheritance support system)软件，建立肺癌中药处方数据库。进入“数据分析”系统，方剂类别选择“肺癌”，使用“频次统计”模块对药物使用频率进行统计，并参照《中药学》教科书对频次>2次中药的功效、性味、归经进行分类。应用Apriori关联规则分析模块，在置信度为0.8条件下，将支持度个数调至26、21、17，分别展示由核心到外围的药物关联规则。采用熵层次聚类分析方法，设置相关度为6，惩罚度为5，基于复杂系统熵聚类以及无监督的熵层次聚类得出用于新方聚类的4条药物组合，并演化出2首用于治疗肺癌的新处方。本研究拟对方二进行进一步的网络药理学分析，以探讨其治疗肺癌的分子机制。

1.4 网络药理学分析 进入中药分子机制在线分析工具(BATMAN-TCM，a Bioinformatics Analysis Tool for Molecular mechANism of Traditional Chinese Medicine，http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)，选择Example-2模块，在Score cutoff为35、AdjustedP-value为0.05条件下，筛选新方活性分子及相应基因。同时以“lung cancer”为检索词，在人类基因数据库(GeneCards，https://www.genecards.org/)寻找支气管肺癌相关基因。依据基因数量，保留打分≥30的基因进行分析。在Venny-2.1(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/)平台导入新处方相应基因(去重后)及肺癌相关基因，通过取两者交集，预测新处方治疗肺癌的靶基因。同时将预测得到的靶标匹配新方活性分子，建立活性分子-潜在靶基因对应关系，并导入Cytoscape 3.7.0构建网络图。使用STRING(https://string-db.org)数据库构建靶基因PPI蛋白互作网络，同时应用Cytoscape软件对核心网络进行分析。将Degree值>10的16个核心靶标导入Metascape(http://metascape.org/gp/index.html)数据库进行靶标途径和通路富集总分析[9]，应用David(https://david.ncifcrf.gov/)数据库对GO功能及KEGG代谢通路进行进一步的深入分析。

2 结果

2.1 数据挖掘研究 86张处方中共用中药158味，合计1 479味次。使用频次≥30次的有12味，前5味分别为半夏、甘草、薏苡仁、白术、砂仁，出现频次均>40次。使用频次≥30次的中药见表1，根据药物数量，对出现频次>2次者进行一级、二级功效分类，见表2。在四气五味方面，以温性、平性、微寒及甘、辛、苦味较多；在归经方面，以归肺、脾、胃经最多，见表3。本研究在置信度0.8条件下，分别设置支持度个数为26、21、17，随着支持度个数的降低，逐渐出现由核心到外围的药物关联规则。如支持度个数为26时的款冬花-甘草、白术-半夏，支持度个数为21时的款冬花-桂枝、白术-黄芪、紫菀-干姜，支持度个数为17时的款冬花-干姜-桂枝等，见图1。在Apriori关联规则分析的基础上，将相关度设置为6，惩罚度设置为5，聚类出4条用于新方组合的药组，见表4。通过对4条中药组合进一步整理，得出2首治疗支气管肺癌的新处方。

表4 新方聚类组合(相关度6，惩罚度5)

图1 中药关联规则(置信度0.8)

表1 使用频次≥30次的前12味中药

表2 使用频次>2次的中药功效分布

表3 中药四气、五味、归经分布(使用频次>2次)

2.2 网络药理学研究 本研究拟对图2中的新处方二(白术-干姜-桂枝-款冬花)进行网络药理学研究。在BATMAN-TCM平台搜集新处方活性分子，去除缺乏结构信息和靶标预测项，共整理出新方活性分子66个，包含白术4个，干姜37个，桂枝14个，款冬花11个，见表5；活性分子相应基因分别为白术26条，干姜739条，桂枝208条，款冬花147条，共获得新处方相应基因1 120条，去重后290条。在Genecards数据库搜集肺癌相关基因22 399个，其中打分≥30的有614条。将614条肺癌基因与290条新处方基因取交集，获得交集基因34个，见图3。将34个交集基因匹配中药活性分子并导入Cytoscape软件，得到活性分子-靶基因网络图，共90个节点，166条边，其中内圈为相应基因，外圈散点为活性分子，见图4。使用STRING、Cytoscape构建靶基因的PPI网络，共34个节点，174条边，平均节点度值10.2，局部集聚系数0.616，见图5。进一步分析其核心网络节点，筛选Degree值>10的16条核心蛋白节点用于进一步的GO功能及KEGG代谢通路富集分析，见图6、表6。使用Metascape数据库对核心靶标进行热图富集总分析，基因组中的所有基因都被用于富集背景，依据P<0.01、最小计数为3、富集因子>1.5收集相关项，并根据其相似度进行分组，将前19条具代表性的富集结果予以展示，见图7。根据DAVID分析结果，核心靶标主要参与的生物过程(BP)共25条，其中P<0.05的有21条；细胞组分(CC)共3条，其中P<0.05的有2条；分子功能(MF)共10条，其中P<0.05的有8条，见图8。KEGG代谢通路分析显示34条，其中P<0.05的有27条，见图9。

图7 Metascape生物途径及通路富集总分析

图8 GO富集分析

图9 KEGG通路富集分析

表6 新处方二中核心靶标(度值>10)

图2 治疗肺癌新处方(相关度6，惩罚度5)

图3 肺癌靶基因韦恩图

图4 活性分子-靶基因网络图

图5 蛋白相互作用网络

图6 PPI核心网络节点

表5 新处方二中4味药材活性分子

3 讨论

中医历来重视痰饮与肿瘤间的关系，因肿瘤是全身疾病的局部表现，肺癌的发生亦与痰饮相关。津液代谢障碍，痰气郁结阻滞中焦气机，久则痰饮内停，聚结于肺，发为肿瘤[10]，故痰饮可能是肺癌发生发展的关键环节。治法方面，当以甘、温之药为主。以甘温除痰饮，盖因肺为贮痰之器，然脾乃生痰之源。古有仲景之黄芪建中汤治肺虚损不足，创甘温培土法；又有东垣谓脾胃一虚，肺气先绝，创甘温健脾之法[11]。

培土生金是古代五行学说在中医治法方面的具体应用，根据“虚则补其母”“其标在肺……其制在脾”等理论，从脾胃入手，通过健脾胃使得肺气充实，土旺则金自生[12]。中医培土生金法在祛邪的同时更加注重扶正的作用，从病因的角度看待疾病的发展，扶助正气，激发患者自愈潜能，不失为治疗肺癌的重要思路[13]。中西并举，遵循“认病辨证”的原则，充分发挥现代医学精准定性、定位，局部肿瘤控制率高的优势，结合中医培土生金的诊疗特色，可极大改善患者的临床获益[14]。尤其在缓解临床症状[15]、防治复发转移[16]、治疗癌因性疲乏[17]、以及对化疗药的减毒增效[18]等方面均体现其独到的优势，值得进一步深入研究。

在宏观层面，本研究从86张肺癌处方中过滤出半夏、甘草、薏苡仁、白术、砂仁等高频药物。以化痰止咳平喘、补虚、清热、利水渗湿、化湿等药物为主，包含了补气、清热解毒、止咳平喘、清化热痰、利水消肿、温化寒痰、补阴等二级功效。通过进一步分析，发现本院治疗肺癌的中药性味以甘温为多，主入肺、脾、胃经。进一步应用Apriori关联规则分析，从核心到外围全面展示了本院治疗支气管肺癌的用药规律。通过熵层次聚类分析，得出“大枣-鱼腥草-山慈菇”“款冬花-桂枝-干姜”“党参-白花蛇舌草-重楼-半枝莲”“款冬花-白术-干姜”四条核心药组。经进一步整合，筛选出2首治疗肺癌的新处方，皆有脾肺同治之意。尤其新处方二，桂枝-白术能化气健脾，干姜-白术善温中化饮，伍以款冬花温肺化痰，四药合用，发挥健脾温肺、培土生金的功效。本研究对处方“白术-干姜-桂枝-款冬花”进行进一步的网络药理学分析，阐释该方培土生金治疗肺癌的分子机制。

从“宏观到微观”角度看，脾胃为气机之枢、居中央以灌四旁，脾胃在人体的特殊地位决定了其对生命调控的特殊作用[19]。肿瘤的发生发展一直伴随着分子、细胞与宿主-肿瘤微环境的相互修饰，中医药改善调节宿主-肿瘤微环境的作用，可能是其抗肿瘤的最终作用机制[20]。本研究结果显示，新处方“白术-干姜-桂枝-款冬花”治疗肺癌具有多靶点-多通路-整合调节的特点，其培土生金的实质内涵可能主要通过影响能量代谢而发挥“补脾”“培土”的功效，通过作用于细胞因子及炎症介质等发挥“温肺”“生金”的作用。一方面，脾胃居中焦，主运化，为“后天之本”“气血生化之源”“气机升降之枢”，脾胃的这些功能特点决定了其与细胞能量代谢的密切关系[21-23]。肿瘤细胞不但可以尽可能多地吸收和利用周围的营养物质，而且可以根据微环境的改变选择更有利的代谢方式[24]。活化的AMPK可以增强分解代谢，抑制合成代谢，应对细胞内外环境的刺激，并且影响细胞的生长、增殖、凋亡、自噬等基本生物学过程，广泛影响肿瘤的发生、生长，发挥重要的肿瘤拮抗作用[25]。另一方面，细胞因子在肿瘤细胞的发生及发展过程中扮演重要角色[26]。首先，有研究[27]提示血清 TNF-α、IL-1β等炎性细胞因子可能参与了NSCLC的发生、发展，且与NSCLC的病理进程和预后密切相关。IFNG基因编码的干扰素-γ(IFN-γ) 在病毒和细菌感染的免疫应答中发挥重要作用，IFNG基因rs2069705位点可能与肺癌风险具有相关性[28]。HIF-1α的高表达与NSCLC临床分期及淋巴结转移密切相关，而CXCR4作为HIF-1α的下游因子之一，两者通过相互调控促进肿瘤细胞的增殖与转移[29]。其次，INS的高低或与肺癌的发展有关。尽管糖尿病和肺癌之间存在诸多混杂因素，其对肺癌影响的详尽机制仍需大量研究深入证实[30]。但胰岛素抵抗和高胰岛素血症的代偿可通过INS及IGF-1受体的激活而发挥促进肿瘤生长的作用[31]。IGF-1在胰岛素受体介导的信号转导中起重要作用[32]。其可能通过自分泌和旁分泌等方式作用于肺癌细胞，并通过AKT信号通路促进人肺癌A549细胞增殖、侵袭与转移[33-34]。此外，MMP9[35]、SERPINE1(PAI-1)[36]表达的上调亦与肺癌的侵袭和转移密切相关。

综上所述，本研究从阜阳市中医医院86张肺癌处方中筛选出以“白术-干姜-桂枝-款冬花”组成的新处方，新处方甘温护中、健脾温肺，体现了培土生金的治则治法。这一治法的实质内涵可能与调节细胞的增殖、分化、凋亡、免疫应答以及炎症反应有关。其可能主要通过影响能量代谢、细胞因子及炎症介质等而作用于肺癌的发生、发展与转移等环节，从而发挥培土生金的作用。