基于网络药理学研究鳖甲煎丸抗肝纤维化的作用机制

丁茂鹏， 韦凌霞， 王志旺， 姚 楠， 庞亚蓉

(甘肃中医药大学药学院，甘肃 兰州 730000)

肝纤维化(hepatic fibrosis, HF)是指由多种致病因素所致肝内纤维组织异常增生的病理过程，其持续发展可导致肝硬化[1]，最好的治疗方法是阻止或逆转其纤维化过程。目前抗肝纤维化的西药疗效尚不明确，而中医药在治疗慢性复杂性疾病方面有明显优势[2]。源于《金匮要略》的鳖甲煎丸具有活血化瘀、软坚散结、补益虚损、祛痰除湿之效，是传统中医治疗疟母的专方，现代多用于治疗肝纤维化，临床上取得了显著疗效[3]。本研究采用网络药理学，从“多成分-多靶点-多通路”的角度探讨鳖甲煎丸治疗肝纤维化的理论依据。

1 材料与方法

1.1 鳖甲煎丸关键成分的筛选 以口服生物利用度(OB)≥30%、类药性(DL)≥0.36、药物半衰期(HL)≥4为条件，在TCMSP数据库对鳖甲煎丸中16味药材的成分进行筛选，同时查阅文献，对具有抗肝纤维化的成分进行了补充。对于6味动物药、1味矿物药，在CNKI、万方数据库中筛选近十年标注有“抗炎”“抗肝纤维化”作用的相关成分。

1.2 鳖甲煎丸靶点的查询与成分-靶点网络的构建 通过TCMSP、CTD、UniProt数据库，查询筛选所得成分的作用靶点及其基因，将其导入Cytoscape3.6.1软件，构建成分-靶点网络，化合物及其靶点由节点表示，2个节点之间的关系由边线表示，每个节点的重要性通过拓扑参数度数进行评判，度数越大，该节点在网络中越重要[4]，筛选出度数靠前者作为核心成分。

1.3 肝纤维化相关靶点的筛选与疾病-中药-成分-关键靶点网络的构建 在GeneCards、CoolGene数据库中输入“hepatic fibrosis”检索肝纤维化的相关靶点，同时进行相关度分析。将鳖甲煎丸成分、肝纤维化的相关靶点进行匹配映射，获得关键成分治疗肝纤维化关键靶点。将疾病、中药、关键成分及关键靶点导入Cytoscape数据库中，构建疾病-中药-成分-靶点网络。

1.4 GO富集分析、KEGG通路分析 利用DAVID平台对关键靶点进行基因本体论(GO)分析、KEGG通路分析，从生物过程、分子功能、细胞组成3个模块进行GO富集分析，采用OriginPro软件将富集结果靠前的条目绘制成条形图。

1.5 PPI网络的构建与分析 在STRING数据库输入关键靶点，限定物种为人，得到蛋白相互作用(PPI)网络图，将结果以TSV格式导出，借助Cytoscape软件计算网络的拓扑参数，并筛选度数靠前的靶点作为后续分析的核心靶点。

1.6 分子对接分析 在Pubchem数据库中询查核心成分的3D结构，将它与核心靶点导入Systems DockWeb Site中进行分子对接，获得对接验证及其对接打分值(Docking score)，大于4.25表明具有一定的结合活性，大于5.0表明分子与靶点具有较好的结合活性，大于7.0表明分子与靶点的结合模型具有强烈的稳定性及活性[5]。

2 结果

2.1 鳖甲煎丸关键成分的筛选 在TCMSP、CNKI数据库中，筛选出鳖甲煎丸植物药中抗纤维化活性较高的70种成分，另外动物药、矿物药共有35种，去掉重复项后得到78种关键成分，见表1～2。

表1 鳖甲煎丸植物药中关键成分

表2 鳖甲煎丸动物药、矿物药中关键成分

2.2 鳖甲煎丸靶点预测 将鳖甲煎丸关键成分输入TCMSP数据库得到对应的靶点，通过Uniprot数据库矫正为标准名称，共得到1 777个靶点；部分动物药、矿物药的化学成分在CTD数据库中查询，共得到276个靶点。将在TCMSP与CTD中检索到的靶点合并，去除重复项后得到478个靶点。将“2.1”项下78种关键成分与478个靶点导入Cytoscape软件来构建成分-靶点网络图，见图1，红色为靶点，蓝色为鳖甲煎丸成分，可知共有555个节点，2 050条边，度数靠前的成分是鳖甲煎丸治疗肝纤维化关键成分，取前9种进行后续研究，见表3。

表3 鳖甲煎丸核心成分

图1 鳖甲煎丸成分-靶点网络

2.3 肝纤维化靶点的预测 通过GeneCards、CoolGene数据库，预测出肝纤维化相关靶点分别为3 926、1 011个，将其与“2.2”项下478个靶点进行交集，得到80个共有靶点，即为鳖甲煎丸抗肝纤维化的关键靶点。将肝纤维化、中药、成分、关键靶点导入Cytoscape软件中，构建疾病-中药-成分-靶点网络图，见图2。

图2 鳖甲煎丸疾病-中药-成分-靶点网络

2.4 GO富集分析、KEGG信号通路分析 将“2.3”项下80个关键靶点输入DAVID网站，进行GO富集分析与KEGG信号通路分析。GO富集分析发现，与鳖甲煎丸抗肝纤维化相关的关键靶点涉及167条生物过程、28种分子功能、20个细胞组分；KEGG通路分析显示，这些关键靶点涉及到107条信号通路，其中前10条过程和通路见图3。

图3 鳖甲煎丸GO富集分析、KEGG信号通路分析(前10条)

2.5 PPI网络的构建 将“2.3”项下80个关键靶点导入STRING网站进行PPI网络分析，同时借助Cytoscape软件筛选核心靶点。结果显示，PPI网络共涉及79个节点，333条边，平均节点度为8.43，取前10个靶点进行后续研究，见图4、表4。

表4 鳖甲煎丸抗肝纤维化的核心靶点(前10个)

图4 鳖甲煎丸PPI网络图

2.6 分子对接分析 表5显示，对接分数4.25～5.0的有7个，5.0～7.0的有25个，大于7.0的有4个；鳖甲煎丸成分、靶点基因的对接分数均大于4.25，大部分集中于5.0～7.0之间。

表5 鳖甲煎丸核心成分与核心靶点的分子对接

3 讨论

本研究采用网络药理学，依托化学成分、靶点及其生物信息等多个数据库，富集鳖甲煎丸治疗肝纤维化的成分、靶点及其相关信号通路，探讨鳖甲煎丸治疗肝纤维化的作用机制。结果显示，β-谷甾醇、槲皮素、山柰酚等9种化学成分匹配到较多的肝纤维化靶点，是鳖甲煎丸治疗肝纤维化的核心成分，这与目前的相关研究结果一致。β-谷甾醇具有抗氧化，抗炎和免疫调节作用，可诱导人肝癌HepG2/ SMMC-7721细胞凋亡，抑制脂多糖/D-半乳糖胺诱导的急性肝损伤[6-7]。槲皮素抑制肝星状细胞活化缓解肝纤维化，通过抑制TGF-β1/Smads信号通路并激活PI3K/Akt信号通路来缓解胆管结扎或CCl4诱导的肝纤维化自噬作用[8]。山柰酚通过下调IL-13和COL1基因表达，抑制胶原蛋白合成，同时上调MMP-2基因表达而促进胶原分解，发挥治疗血吸虫肝纤维化的作用[9]。

在作用机制分析过程中，发现IL-6、TNF及MAPK等10个靶点发挥核心作用，它们主要涉及肝炎、肝纤维化及肝硬化等病理过程。IL-6是与肝纤维化关系最密切的细胞因子，能激活STAT3信号转导通路[10]。IL-6通过mTOR/STAT3信号途径，刺激CD4+T淋巴细胞胞内蛋白STAT3磷酸化及表达增加，STAT3磷酸化后形成二聚体进入细胞核，通过调节基因转录，促进Th17细胞增殖、分化，加速Th17细胞表达IL-17，造成肝衰竭[11]。TNF-α主要由淋巴细胞、单核巨噬细胞分泌，能够刺激内毒素诱导细胞因子IL-6、IL-8等的表达，进而介导肝细胞炎性反应，促进肝纤维化的发展[12]。MAPK1是MAPK信号通路的重要信号通路蛋白，主要参与细胞增殖、生长及分化等过程的调控，在癌症的发展过程中具有促进作用[13]。上述因子之间又存在着密切的关系，如JAK/STAT3通路与MAPK通路协同调节炎症介质TNF-α的转录活性[14]。EGFR和TP53与肿瘤的发生、发展关系十分紧密，EGFR是原癌基因c-erbB-1(HER-1)的表达产物，参与肝组织再生过程[15]，而TP53在肿瘤发生、发展及转移过程中发挥重要作用[16]。通路富集的结果显示，鳖甲煎丸关键成分作用的关键靶点分布于不同的信号通路，可通过多通路协调发挥抗肝纤维化作用。此外，本研究采用了分子对接技术，探讨了核心成分与核心靶点之间的结合能力，为鳖甲煎丸所含核心成分治疗肝纤维化提供了理论依据。

综上所述，本研究采用网络药理学方法，对鳖甲煎丸治疗肝纤维化多成分-多靶点的复杂网络关系进行了系统分析，结果提示鳖甲煎丸通过多种成分、多靶点、多通路发挥抗肝纤维化的综合作用。