不同模式紫外线照射羊角膜内浸润核黄素浓度的检测研究

崔传波，葛庆曼，徐志鸿，牟国营

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2山东医专附属眼科医院；3临沂市中医医院；4山东省立医院)

角膜交联术(Corneal crosslinking，CXL)是采用紫外线A光和光敏剂核黄素诱导角膜胶原纤维相互交联，从而提高角膜硬度和改善角膜生物学性能的新方法[1]。该法的有效开展主要依赖于紫外线A与核黄素之间的光化学反应，其强度主要取决于紫外线A光能量的吸收量，产生的生物效应与组织对紫外线A光的总吸收量成正比[2]。因此，临床上开创了多种快速角膜交联模式，在保证总吸收量不变的情况下，通过提高紫外线A光照射能量和缩短照射时间，以达到相同的交联效果。目前，常用的紫外线交联模式有以下几种：3 mW/cm2×30 min、9 mW/cm2×10 min、18 mW/cm2×5 min、30 mW/cm2×3 min。已有文献从交联过程中氧气的消耗来分析不同能量紫外线在不同时间内导致不同角膜生物力学改变[2]，但核黄素浓度在交联过程中的变化却未见报道。为此，本研究进行了相关探讨。

1 材料与方法

1.1实验材料与设备 新鲜羊角膜96只、0.1%的核黄素溶液、玻璃器皿；紫外线角膜交联仪(美国Ave-dro，KXL系统)，电子分析天平秤(上海民桥精密科学仪器有限公司，FA2204N)，高效液相色谱仪(日本SHIMADZU，LC-20AT SPD-20A)。

1.2方法 将新鲜羊角膜去上皮后置于玻璃器皿中，用0.1%的核黄素溶液每2 min点角膜1 次，持续30 min后随机取出6只测定核黄素浓度；其余90只分成3组，每个模式组30只，分别用3、9、18 mW/cm2的紫外线(370 nm)进行照射。核黄素浓度：3 mW/cm2组分别于照射后5、10、15、20、30 min检测；9 mW/cm2组分别于照射后2、4、6、8、10 min检测；18 mW/cm2组分别于照射后1、2、3、4、5 min检测。各时间点均取6只角膜，取照射中央直径8 mm角膜片，电子分析天平秤重后制成匀浆液，用高效液相色谱法检测核黄素的浓度。

2 结果

各组角膜交联开始后，角膜基质内核黄素浓度均快速下降(F=10.52～17.62，P<0.01)；3 mW/cm2×30 min模式于第2个时间点即10 min时角膜基质内浓度较低(P<0.05)；9 mW/cm2×10 min模式于第4个时间点即8 min时，角膜基质内核黄素浓度较低(P<0.05)；18 mW/cm2×5 min模式于第2个时间点即2 min时角膜基质内浓度最低(P<0.05)。见表1。

表1 三种模式不同时间点角膜内核黄素浓度变化情况

3 讨论

CXL是近年临床常用的角膜成形术，能够有效阻止或减缓圆锥角膜、准分子激光术后角膜扩张以及难治性角膜溃疡等[3-4]，减少了不必要的角膜移植，有助于解决我国角膜供体严重缺乏的难题。核黄素由特征性的异咯嗪环系统组成，具有光敏特性，在反应中形成核糖醇基侧链，在较短时间内分解为黄光素和黄色素。核黄素在交联过程中起到关键作用：一是在紫外线A照射下产生活性氧基，诱导胶原纤维间形成新的连接[5]；二是提高紫外线A的吸收率，从而保护角膜内皮、晶状体及视网膜等眼部结构[6]；三是在交联过程中润滑暴露于空气中的组织以防干燥。角膜交联使用370纳米波长的紫外线，核黄素吸收UVA能量，电子迁移到高能级轨道，使核黄素分子被激发至三线态(3Rf)，诱发Ⅰ、Ⅱ型光化学反应，形成角膜胶原纤维间化学共价键，使角膜胶原纤维直径增粗，提高角膜基质对多种降解酶作用的抵抗力等多重生物学效应，从而使角膜基质的机械强度增加。因此，角膜基质内核黄素浓度可能会影响Ⅰ、Ⅱ型光化学反应的进程，从而影响角膜胶原纤维间化学共价键的形成。

有研究提出角膜基质内核黄素需达到15 μg/g的浓度才能安全、有效地开展胶原交联。本研究首次检测了临床常用的三种不同交联模式下角膜基质内核黄素浓度，发现所有角膜在交联开始后不同时间的基质内核黄素浓度存在差异，说明不同紫外线照射强度对核黄素分子的激发作用不同；本研究还观察到紫外线强度越大，核黄素消耗的速度越快，可能核黄素的消耗与紫外线的强度有相关性。

综上所述，本研究发现3 mW/cm2×30 min模式和18 mW/cm2×5 min模式角膜基质内核黄素浓度均能满足临床需要，仅有9 mW/cm2×10 min模式段时间内不能满足交联需要。因此，需进一步寻求交联过程中核黄素的给药方法。