Livin及MDR基因在胃癌患者中的表达及临床意义

董 立，付 丽，张 曦，谢 乐*

(1山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000；2临沭县妇幼保健院；3山东医专附属医院)

胃癌是我国常见的、位居第二的癌症，早期患者诊出率低，初次发现者多为中晚期，5年生存率约在2%。因此，在分子水平甚至基因水平上探讨胃癌的发病机制对改善其治疗效果具有重要意义，本研究对此进行了相关探讨。

1 资料与方法

1.1临床资料 选择2019 年3月—2020年8月本院收治的35例胃癌患者作为观察组，患者均经组织病理学确诊，其中男23例，女12例；年龄29～63(35.18±10.52)岁，其中年龄≥45岁者24人，年龄<45岁者11人。同期选取28例胃炎患者为对照组，患者均经临床和实验室检查确诊，其中男15例，女13例；年龄22～53(34.87±8.96)岁。两组年龄及性别比均无统计学意义(P>0.05)，具可比性。排除标准：既往胃部手术史者；长期酗酒者；患免疫系统或内分泌系统疾病者；服用免疫抑制剂者；服用抗幽门螺杆菌治疗者。

1.2方法

1.2.1标本采集 两组患者空腹8～12 h后，采集约3 ml静脉血，注入含EDTA-K2试管中，随即混匀6次，分离单个核细胞(PBMC)，用PBS缓冲液清洗3遍，-80℃冰箱冻存待测。

1.2.2检测方法 提取上述标本中的RNA，然后用紫外分光光度计测定其纯度，A260/A280比值应处于1.8～2.0。经琼脂糖凝胶电泳分离后出现3条清晰核酸条带，说明RNA提取效率较好。然后，取上述提纯后的RNA样品5 μg，分别加入OLigo(dT)primer(0.5 g/L)1 μL，DEPC处理水，至终体积均为12 μl，然后在70℃条件下水浴5 min。冰上骤冷后，加5×逆转录缓冲液7 μl，加RNA 酶抑制剂20 U，加dNTPs 4μl，40℃水浴5 min后置于冰上，加入逆转录酶200 U，反应体系总体积28μl，42℃反应68 min，最后70℃下放置15 min终止。将所获cDNA于-80℃冰箱冻存待测。建立PCR检测体系，该体系总体积为25μl，包括逆转录产物5μl，20μmoL/L上、下游引物各1μl，引物序列见表1，2.5 mmoL/LdNTP 5μl，10×PCR反应缓冲液5μl，25 mmol/L的MgCl24μl，TaqDNA聚合酶2 U，其余以DEPC水补至25μl。Livin的扩增条件为：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性42 s，62℃复性40 s；72℃延伸55 s，35个循环。最后72℃延伸5 min。MDR扩增条件为：94℃预变性5 min，1个循环；94℃变性46 s，60℃复性45 s；72℃延伸50s，32个循环。最后72℃延伸7min。最后采用2%琼脂糖凝胶对PCR扩增产物进行电泳(75V，45 rain)分析，在紫外透射仪下观察。

表1 PCR引物序列

2 结果

2.1两组Livin及MDR基因表达的比较 Livin基因：观察组阳性率为54.29%(19/35)，对照组为14.29%(4/28)，两组比较有统计学意义(χ2=9.08，P=0.003)。MDR基因：观察组的阳性率为71.4%(25/35)，对照组为17.8%(5/28)，两组比较有统计学意义(χ2=15.81，P<0.01)。

2.2胃癌患者Livin及MDR表达与临床指标的关系 Livin、MDR的表达与组织分化程度有关；Livin与淋巴转移有关。见下表2。

表2 胃癌患者Livin及MDR的表达与临床指标的关系

2.3胃癌患者Livin与MDR表达相关性分析 在胃癌患者样本中，Livin与MDR的表达无明显相关性(r=-0.200，P=0.251)。见表3。

表3 胃癌组织Livin与MDR表达相关性分析

3 讨论

Livin基因定位于人类染色体的10q23.3，全长218 kb，有9个外显子，8个内含子，其主要结构功能区位于N端，编码蛋白质的相对分子质量为56 000，分布在胞质中。有研究显示，Livin在大多数正常成人中几乎不表达，而在多数实体肿瘤中呈现较高的表达水平，主要通过与caspase-3/-7/-9结合，阻断与caspase高度相关的死亡受体途径和线粒体途径[1]。本研究证实，胃癌患者中的Livin表达明显升高，分化程度较差者及伴淋巴结转移者阳性表达更高，与患者的年龄、性别无关。

MDR1是非常重要的细胞耐药基因，可产生单向药物外输蛋白P-gp，该蛋白由ATP提供能量，可将细胞内某些成分转移出细胞外，如代谢废物、某些药物等，从而保护细胞免受毒物及代谢产物损害；同样，P-gp可增加细胞内抗肿瘤药物的外运，导致其浓度下降。该基因在体内激活后，将导致肿瘤治疗效果变差[2-3]。因此，MDR1的监测可以作为评价肿瘤细胞耐药的指标。本研究证实，胃癌患者中的MDR呈高表达状态，与肿瘤组织分化程度有关，但与是否发生淋巴结转移及患者的年龄、性别无关。

总之，随着科学研究的不断深入，对胃癌高危人群进行Livin和MDR等基因检测越来越成为可能，从而提高胃癌的早期检出率。本研究样本量较小，对胃癌生物学行为划分较粗，还需要进一步开展对胃癌分化程度、浸润程度、预后评价及临床治疗的研究。