糖尿病肾病发展为终末期肾病潜在机制的生物信息学研究

李 君 李 见 王世信

1.枣庄市立第四医院内一科，山东枣庄 277599；2.徐州市中心医院检验科，江苏徐州 221009

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的重要并发症之一，已成为发达国家终末期肾病（end stage renal disease，ESRD）的首要危险因素[1]。透析治疗是目前ESRD主要的治疗方式，但透析治疗容易并发心血管意外、血管相关意外、感染等并发症，增加ESRD的死亡率[2]。ESRD的发病机制和安全有效的治疗方案有待进一步研究。DN是ESRD发病的独立危险因素[3]。有证据表明，炎性反应参与DN的病理过程，DN发病与TLR-4/NFκB信号通路密切相关[4]。但DN发展为ESRD的具体机制尚未完全明确。目前，基因组学在医学领域的应用范围逐渐扩大，以基因组学为基础的生物信息学方法可短时间内获取并分析海量的基因表达数据，深入挖掘疾病的潜在机制和核心通路[5]。本研究利用生物信息学方法挖掘DN发展为ESRD的潜在机制和核心靶点，为ESRD的防治提供新的思路。

1 材料与方法

1.1 DN和ESRD差异表达基因筛选

在美国国家生物技术信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）中检索获取芯片数据。下载GSE142153数据集，该数据集包含7例ESRD患者、23例DN患者、10例健康对照对象的外周血单个核细胞的基因表达数据。利用R语言软件中的“limma”和“pheatmap”对 GSE142153数据集进行标准化处理，以P＜0.05、|fold change|≥2为条件进行差异表达基因筛选和聚类分析，并将结果可视化。

1.2 DN和ESRD共同差异表达基因筛选

将DN和ESRD差异表达基因导入生物信息学与进化基因组学网站的韦恩图绘制模块，分别将上调和下调的DN和ESRD差异表达基因取交集，即可获得DN和ESRD共同差异表达基因，即DN发展为ESRD的潜在靶基因，绘制韦恩图。

1.3 潜在靶基因富集分析

以P＜0.05为条件，利用R语言“ClusterProfiler”数据包对筛选得到的潜在靶基因进行京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）信号通路和基因本体（gene oncology，GO）富集分析，并将富集结果可视化。

2 结果

2.1 DN差异表达基因筛选

经标准化处理和筛选，与正常对照组相比，DN组样本存在160个差异基因，其中上调基因100个，下调基因60个；ESRD组样本存在74个差异基因，其中上调基因37个，下调基因37个。经数据标准化和聚类分析，绘制数据标准化后差异基因表达火山图和热图，见图1。

图1 使用Fold change和校正后P值绘制火山图和热图

2.2 DN和ESRD共同差异表达基因筛选

将上调和下调的DN和ESRD差异表达基因分别取交集，获得DN和ESRD共同上调差异表达基因12个，下调差异表达基因10个，即DN发展为ESRD的潜在靶基因，绘制韦恩图，见表1及图2。

表1 DN和ESRD共同差异表达基因

图2 DN和ESRD差异表达基因韦恩图

2.3 潜在靶基因富集分析

富集分析结果表明，上调的潜在靶基因显著富集于氮素代谢信号通路；涉及蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶活性等分子功能、血红蛋白复合物等细胞组分和红细胞分化等生物学过程。下调的潜在靶基因未得到相关富集结果，表明DN发展为ESRD的过程中，差异基因以上调表达为主，见图3。

图3 潜在靶基因富集分析

3 讨论

DN是最常见的慢性肾脏疾病，也是ESRD的主要原因[6]。DN被认为是血流动力学和代谢因素相互作用的结果，其发病机制涉及多因素、多途径，其中炎症起主要作用[7]。此外，氧化应激反应也是加重DN患者肾损伤的重要因素，可加快DN向ESRD进展的速度[8]。有学者认为，血、尿肾损伤分子（kidney injury molecule，KIM）1水平可能成为DN进展的生物标志物[9]，也有研究指出，TNF受体超家族成员与ESRD的发病密切相关[10]。但DN向ESRD进展的潜在机制尚未完全明确。ESRD严重影响患者的生活质量[11]，明确ESRD的发病机制，探索其发病的关键靶点，对提高ESRD疗效、改善患者的生活质量意义重大。

本研究利用生物信息学方法挖掘发现，DN发展为ESRD的过程中，差异基因以上调表达为主，上调的潜在靶基因显著富集于氮素代谢信号通路；涉及蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶活性等分子功能、血红蛋白复合物等细胞组分和红细胞分化等生物学过程。

氮的代谢水平与肾病关系密切，研究表明，当合并急性肾损伤时，患者肾小球滤过能力显著降低，含氮以及非含氮代谢产物发生蓄积，患者死亡率增加[12]。与肾病相关的非蛋白氮代谢产物分别有血清肌酐、尿素氮、尿酸等，也是肾功能的重要指标[13]。研究表明，肠道菌群与慢性肾脏病关系密切，肠道菌群可以通过促进含氮废物的排除等途径，减轻肾衰竭模型动物的肾损伤程度[14]。

γ-谷氨酰转移酶是一种细胞分泌酶，主要存在于肾脏、胰腺、肝脏等组织器官中。研究证实，γ-谷氨酰转移酶与慢性肾脏病的进展程度密切相关，可以作为慢性肾脏病进展的独立预测因素[15]。韩国一项纳入600余万例的研究表明，γ-谷氨酰转移酶可以作为ESRD进展的预测因子[16]。

铁参与人体的多种生理过程，包括氧的运输、酶的活性和能量的代谢等。铁稳态失衡与多种病理过程有关，铁稳态的紊乱和铁介导的细胞毒性与肾脏损伤互为因果[17]。肾脏通过尿液的重吸收过程参与全身铁稳态的调节，肾脏中铁的蓄积和尿中铁浓度的增加与各种肾脏疾病和肾损伤的病理过程相关[18]。铁在红细胞生成和血红蛋白的合成过程中发挥重要作用，这使得红细胞的生成过程消耗了体内绝大部分铁，也是体内铁代谢的重要途径。红细胞生成过程中，赤铁酮表达增多，可以抑制铁调素的表达，调剂体内铁的平衡[19]。血红蛋白复合物等细胞组分和红细胞分化等生物学过程可能会通过介导铁的代谢发挥干预终末期肾病的病理过程。

综上所述，DN发展为ESRD的过程中，差异基因以上调表达为主，上调的潜在靶基因显著富集于氮素代谢信号通路；涉及蛋白质-谷氨酰胺γ-谷氨酰转移酶活性等分子功能、血红蛋白复合物等细胞组分和红细胞分化等生物学过程。本研究挖掘获取的差异基因均来自DN、ESRD和健康人的外周血液样本的测序结果，但由于样品标准化和富集分析过程中可能存在的主观因素影响，研究结果可能存在偏差，挖掘得到的核心靶点和信号通路在DN发展为ESRD过程中的机制有待进一步实验验证。