叶绿素铜钠盐的研究进展

杨馥毓，丁小强，田 芳，方 舟，罗舜菁，刘成梅，熊 勇,*

1.南昌大学 食品学院 (南昌 330047)2.江西丹霞生物科技股份有限公司 (鹰潭 335200)

叶绿素是一种安全且具有一定生理功能的天然色素。现代研究发现，叶绿素不仅可以在食品或化妆品中用作天然着色剂，而且还有重要的生理活性，如抗致突变、降解胆固醇和改善便秘等作用[1]。除此之外，由于叶绿素的分子结构和人体血红蛋白的分子结构极其相似，区别仅在于两者的中心离子不同，所以，叶绿素也被应用于治疗贫血症[2]；另外，叶绿素也能够提高正常红细胞的生长，增加机体含氧量，促进细胞分裂，从而有助于人体的新陈代谢[3]。但是，叶绿素不溶于水，在光照和一定的温度条件下极易发生分解，从而其应用受到局限。研究表明，通过使用铜、铁、锌等金属离子置换叶绿素中心镁离子生成的产物比叶绿素的稳定性和水溶性更强，而且仍具有与叶绿素类似的色泽和生理功能，因此有大量关于叶绿素衍生物的相关研究，其中采用铜离子置换镁离子生成叶绿素铜钠盐是最广泛采用的方法[2]。

本文概述了叶绿素铜钠盐的结构和性质，重点总结了叶绿素铜钠盐的制备工艺，并提出了其中存在的问题与可能的改进方法，为其进一步研究和相关产品的开发提供理论依据。

1 叶绿素铜钠盐的结构和性质

1.1 叶绿素铜钠盐的结构

叶绿素铜钠盐的分子式为C34H31O6N4CuNa3和C34H30O5N4CuNa2，相对分子质量约为724.17和684.16。叶绿素铜钠盐是利用叶绿素为基础通过一系列反应制备而成的产物。叶绿素是包含四个吡咯环，相互之间以甲烯基(=C-)联结，从而形成稳定的共轭体系，共轭体系中心结合着一个镁离子，在共轭体系的侧链上连接着两个酯化的羧基基团，分别是与甲醇、植醇所酯化[4]。叶绿素铜钠盐是在叶绿素的基础上，发生皂化反应脱去植醇和甲醇，且在酸性条件下，Cu2+取代Mg2+而生成的产物，叶绿素及叶绿素铜钠盐的分子结构如图1所示。

1.2 叶绿素铜钠盐的性质

叶绿素铜钠盐易溶于水，微溶于醇类，不溶于油脂和石油醚。其色泽为墨绿色，状态为粉末状。其水溶液为透明的蓝绿色。若有Ca2+存在，则有沉淀析出。通过紫外可见光谱扫描可知，在405 nm±3 nm和630 nm±3 nm的两个波长范围内均有最大吸收峰。

2 叶绿素铜钠盐的功能应用

2.1 食品应用

叶绿素铜钠盐被批准可在果冻、蔬菜罐头、糖果、饮料、果蔬汁类饮料、焙烤食品、配制酒、等产品中使用[5]。

2.2 医疗应用

通过研究发现叶绿素铜钠盐有保护和促进肝脏的功效，还能够治疗黄疸等疾病[6]；而且叶绿素铜钠盐能够增强造血功能，促进血红蛋白的生成，治疗贫血等症状[7]；叶绿素铜钠盐具有调节口腔微生物，防治蛀牙、牙周炎，消除口腔和呼吸道异味的作用[8]。另外，叶绿素铜钠盐还被用于湿疹、冻疮、急性胰腺炎等病症的治疗[9]。

2.3 染色应用

叶绿素铜钠盐能够用于染色，是一种环保、节能的染料。利用其进行染色，不但能够充分利用生物质资源，还符合当前人们追求生态环保的理念。王娜，杨瑞玲等[10-11]通过研究发现，叶绿素铜钠盐染料适合在酸性条件下染羊毛、蚕丝和锦纶，这些材质经过叶绿素铜钠盐染色之后的色牢度也可以达到3级以上。

2.4 其他应用

Ruan[12]通过研究发现，以叶绿素铜钠盐为电极的全固态超级电容器具有良好的弯曲能力和柔韧性。这也表明叶绿素铜钠盐在全固态超级电容器方面具有潜在的应用。

3 叶绿素铜钠盐的制备工艺研究

叶绿素铜钠盐的制备包括：叶绿素的提取，利用叶绿素制备叶绿素铜钠盐。

3.1 叶绿素提取

研究表明，提取叶绿素的方法主要包括溶剂提取法、超声波辅助提取法、超临界流体萃取法等方法[13]。其中最常用的方法是溶剂提取法。该方法是依据相似相溶的原理，提取溶剂和被提取物质的化学性质越相似，被提取物在溶剂中的溶解能力就越大，就越容易被提取出来。叶绿素含有一个亲水性的卟啉基团和一个亲脂性的叶绿醇的结构[13]。亲脂性的叶绿醇具有20个碳原子，较长的碳链决定了其极性较小，亲脂性较强而亲水性较弱，相反亲水性的卟啉结构增强了其极性。因此，提取叶绿素最佳的溶剂是中等极性的有机溶剂，例如丙酮、乙醇、乙醚等。常见的溶剂的极性如下表1所示。

表1 某些溶剂的介电常数

杨军[14]通过实验对比了100%无水乙醇、100%丙酮等十几种溶剂对叶绿素提取率的影响，结果为质量分数为85%的丙酮-无水乙醇(1∶2，v/v)复配为最佳提取溶剂。复配的溶剂比单一溶剂的提取效果更好，可以认为是一种协同萃取效应，也可以认为复配溶剂的性质与被提取物更加相似，因而提取率更高。虽然采用丙酮与其他溶剂的复配液具有较高的叶绿素提取率。但是，丙酮的闪点低、易爆、挥发性较强，在大规模的工业化使用中具有一定的危险性。因此采用安全性高、低毒的试剂替代丙酮作为叶绿素的提取溶剂是必要的。乙醇挥发性低、毒性低且安全性高，而且对于叶绿素有较高的提取率，因此成为工业化提取叶绿素的最佳试剂。

叶绿素位于叶绿体片层的蛋白质和脂脂中间，其中亲水性的卟啉基团连接蛋白质，亲脂性的叶绿醇连接脂质层。提取叶绿素时适当加入少量的水有利于叶绿素亲水性基团和蛋白质的分离，从而促进叶绿素的提取。房家详[15]通过研究发现，乙醇与水浓度比为4∶1时，叶绿素的提取率最大——12.8 g/kg，使用100%乙醇提取叶绿素时，提取率反而减少。

超临界流体萃取技术作为新型分离技术，其操作温度低、分离效率高且溶剂回收率高，近年来开始应用于植物和中草药有效成分的提取。Lefebvre[16]通过研究发现，通过超临界流体萃取的方法，在二氧化碳中添加30%的极性改性剂能够获得叶绿素。

超声辅助萃取技术也经常被应用于分离提取中，超声波的振动空化作用能够促进细胞的裂解，从而有利于溶剂的提取，Choi[17]通过研究表明，利用超声波辅助提取叶绿素的提取率比有机溶剂提取法更高。

3.2 叶绿素铜钠盐的制备

叶绿素铜钠盐的制备，包括皂化、酸化、铜代以及成盐四个反应步骤。另外，由于原料中的叶绿素含量极少，提取之后会含有很多杂质，因此除了这些必要的反应步骤还会加入纯化除杂的步骤。事实上，现有的工艺存在一定的弊端，例如皂化不完全、铜代“失绿”，以及纯化效果差、产品质量低等，因此有待进一步改进。

3.2.1叶绿素铜钠盐制备原理

(1)皂化

叶绿素分子上的两个酯基和氢氧化钠发生皂化反应，脱去植醇和甲醇，生成水溶性的叶绿素钠盐(以叶绿素a为例，见图2)。

图2 皂化反应的反应方程式

(2)酸化

在酸性环境中，氢离子取代叶绿素钠盐中的镁离子和钠离子，生成叶绿酸及硫酸镁和硫酸钠(见图3)。

图3 酸化反应的反应方程式

(3)铜代

在酸性介质中，加入一定量的CuSO4溶液，叶绿酸分子中的氢离子会被铜离子取代生成墨绿色的叶绿素铜酸(见图4)。

图4 铜代反应的反应方程式

(4)成盐

将叶绿素铜酸溶解，与氢氧化钠溶液反应，可得到水溶性叶绿素铜钠盐(见图5)。

图5 成盐反应的反应方程式

3.2.2制备工艺存在的问题及改进

叶绿素的皂化程度不仅会影响铜代反应的进行，而且也会影响叶绿素铜钠盐的产量、色泽和质地。有研究通过探究pH值对皂化反应的影响，得出pH=11或12时是最佳皂化条件[3, 18-21]。但是目前市场上大多数pH计和pH试纸只适合在水溶液中使用，而叶绿素的提取溶剂为高浓度的乙醇、丙酮等有机试剂，在此条件下测得pH值存在一定的偏差且不稳定。因此皂化反应要根据NaOH的实际添加量进行探究，而不能仅依据pH值。叶绿素为脂溶性物质，皂化前可以溶解于石油醚，皂化后生成水溶性的叶绿素钠盐不溶于石油醚，因此，皂化反应之后在其中加入石油醚进行萃取，通过分层情况与石油醚层状态也可以预判皂化反应是否完全。萃取相和萃余相两相分层清晰且石油醚层呈黄色可判断反应较完全[21]。

对叶绿素铜钠盐进行酸化铜代时，很多研究在叶绿素钠盐水溶液中加入一定浓度的硫酸溶液从而将pH调到2.5左右，反应一定的时间后加入硫酸铜溶液[22-24]。事实上，直接将pH调为2.5可能会破坏叶绿素钠盐的卟啉结构，从而使得生成的叶绿素铜酸失绿，进而影响叶绿素铜钠盐的品质。酸化目的是为了更好、更方便地进行铜代，同时酸化也是为了避免硫酸铜与氢氧化钠发生反应，生成氢氧化铜等其他物质。因此，酸化铜代时先将pH调为中性，加入适量硫酸铜进行反应，然后再将溶液调为2.5，这样能够避免太强的酸性环境可能会造成叶绿素钠盐中卟啉结构的破坏。

由于叶绿素在原料中含量极少，提取之后的杂质相对较多，因此纯化步骤是必要的。在叶绿素铜钠盐的制备过程中，皂化反应生成叶绿素钠盐后加入石油醚进行溶剂萃取，目的是除去脂肪、胡萝卜素、叶黄素和植物醇等脂溶性物质，是为了获得较高的产品品质[25]。溶剂萃取时，各成分在两相溶剂中分配系数相差越大，其分离效果越好，杂质去除率越高。传统工艺是在乙醇中进行皂化反应生成叶绿素钠盐，再利用石油醚萃取除杂。事实上，利用乙醇-石油醚两相进行溶剂萃取的效果较差，这是因为部分亲脂性杂质在乙醇中的溶解度也较大，从而使得除杂效果不理想。如果将乙醇回收，叶绿素钠盐只是溶于水，水与石油醚的极性相差较大，从而能够获得更好的除杂效果。除此之外，单一溶剂进行多次萃取只能除去少量在该溶剂中溶解度较高的杂质。而采用不同极性的多种试剂进行萃取能够将多种杂质萃取分离出来，从而增强其除杂效果。因此选用3～4种不同极性溶剂如乙酸乙酯、丁醇、氯仿、石油醚进行溶剂萃取，由低极性到高极性将叶绿素钠盐水溶液分步进行萃取，除去极性不同的杂质。

除此之外，在铜代反应生成叶绿素铜酸后使用水、低浓度醇、石油醚等进行洗涤除杂，使用水洗涤能够除去过量的钠离子、铜离子等水溶性杂质，使用低浓度醇洗涤能够去除未被皂化的极性物质，使用石油醚洗涤除去脂溶性杂质，最终将叶绿素铜酸粗品洗涤成墨绿色带有金属光泽疏松颗粒状精品。这些步骤也是为了纯化除杂，获得较高的产品品质。

4 总结与展望

当前，由于食品安全意识的增强，许多合成色素被禁止使用，安全、天然的产品更加受到人们的青睐，从而为天然色素市场开发提供了良好机遇，天然食用色素逐渐成为朝阳产业。叶绿素铜钠盐作为安全的天然色素，不仅可以作为着色剂添加到食品中，而且在医药方面具有良好的效果与应用。但是由于原料中的叶绿素含量很低，提取之后有较多的杂质，再加上现有制备工艺中存在一定的缺陷，从而导致市场上售卖的叶绿素铜钠盐产品大多品质较低，因此亟需从不同角度入手改善叶绿素铜钠盐的制备工艺和提纯方法。