基于网络药理学探讨止泻散治疗小儿迁延性慢性腹泻的潜在机制

王丹谊，朱万青，李 娟，李伟伟，李志峰

（广西中医药大学第一附属医院，广西 南宁 530023）

迁延性慢性腹泻（persistent and chronic diar⁃rhea，PCD）是指病程在2 周以上的腹泻，是儿科的常见疾病与多发疾病。研究发现，该病每年造成250万婴儿死亡，5 岁以下儿童中每1 000 名儿童死亡率为4.9%［1-2］。在发展中国家和工业化国家，持续性和慢性腹泻最常见、最重要的原因仍然是肠道感染［3-4］，包括细菌和病毒感染。一项针对199 名患儿腹泻标本的检测发现，病毒检出率为48.7%，其中轮状病毒A 是最常见的检出生物（34.67%），其次是诺如病毒GIIGII（20.6%）；细菌阳性检出率为40.2%，最常检测到弯曲杆菌（22.11%），其次是艰难梭菌毒素 AAB 和沙门氏菌［5］。现代研究认为，PCD 与体液、细胞免疫功能降低、肠道菌群失调、肠黏膜持续损害、黏膜修复迟缓等有关［6-8］。腹泻病长期反复发作，可造成营养不良、贫血等并发症，严重会影响儿童的生长发育，故针对迁延性慢性腹泻的治疗以去除病因，恢复患儿胃肠生理功能，促进生长发育为原则，但是西医治疗个体化不足，临床疗效欠佳。

PCD 属中医“久泻”“泄泻”等范畴［9］，中医药治疗小儿腹泻积累了丰富经验，对于迁延性慢性腹泻采用中医辨证施治疗效明显。《幼幼集成》言：“集成止泻散治久泻如神，此方经验最多。”可见止泻散常用来治疗久泻。而止泻散组方中药的活性成分较多，说明止泻散可能是通过多成分的协同作用而起效，但关于止泻散治疗PCD 的分子机制尚未明确。而网络药理学是通过整合多个数据库的相关信息，构建生物信息网络，进一步分析网络拓扑结构以及选取特定信号节点实现药物作用多靶点预测。网络药理学的研究策略涵盖了多个靶点，将药物-靶点网络与生物系统网络相结合，可为新药研发提供新途径和新策略［10］。本研究应用多个数据库综合挖掘和筛选止泻散组方中药的活性化学成分及药物作用靶点，从而探索止泻散治疗PCD的作用及分子机制，以期为止泻散治疗PCD的研究提供新思路和新途径。

1 资料与方法

1.1 数据库及软件选择 中药系统药理学数据库TCMSP（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）、GeneCards 数 据 库（https：//www. genecards. org/）、OMIM 数据库（http：// www.omim.org/）、STRING 10.5数据库（http：//string-db.org）、UniProt数据库（https：//www.uniprot.org/uploadlists/）、KEGG 数据库（http：//www.kegg.jp/）、David数据库（https：//david.ncifcrf.gov/home.jsp）等以及R软件、Cytoscape 3.7.2软件。

1.2 止泻散组方药物活性有效成分靶点筛选 中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP，Tradition⁃al chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform）是一个药理学平台，它能捕捉药物、靶标和疾病之间的关系。该数据库包括化学物质、靶点和相关的药物靶点网络，以及涉及口服生物利用度、类药性指数等天然化合物的药代动力学特性。 通过访问TCMSP 数据库，以“茯苓”“山药”“车前子”“甘草”为关键词检索止泻散中的化学成分。在数据库收集止泻散中的化学药效成分信息，选择口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%［11］，类药性指数（drug like index，DL）≥0.18［12］，搜索并筛选该数据库中所包含的止泻散中药物的有效活性成分及毒药物动力学（absorption，distribution，metabolism and excretion，ADME）信息，将所得信息保存为txt 文本格式，并制成三线表。此外，在TC⁃MSP 在线数据库平台Ingredients 获得筛选得到的止泻散中药物有效化学活性成分相对应的靶点蛋白。

1.3 网络构建及核心靶点筛选 通过登陆Gene⁃Cards和OMIM 数据库，以“persistent and chronic diar⁃rhea”为关键词，检索与PCD 相关基因靶点，将上述检索到的基因、靶点结果进行整合，将信息录入txt文本中，与“1.2”项获得的靶点进行交集比对，利用R软件包“VennDiagram”包绘制止泻散中包含药物靶点与PCD 相关发病机制靶点网络图，最终获得止泻散治疗PCD 的潜在作用靶点，将获取信息录入txt文本中。STRING 数据库是一个储存已知和预测未知蛋白质相互作用的在线软件，可对每个蛋白相互作用信息进行评价分析、赋值，分值越高，可信度越好［13］，从而得出蛋白竞相作用的详细信息。将“1.2”项所得的止泻散有效活性成分和潜在作用靶点信息上传 STRING10.5 数据库（http：//string-db.org）在线软件，将限定研究物种设置为人类，获得PPI 网络图，点击exports 选择“TSV：tab separated values-can be opened in Excel”下载数据，并将得到的文件导入Cytoscape 3.7.2，得到止泻散对PCD 作用靶点的蛋白互作网络关系，并进行拓扑学分析。

1.4 有效成分-靶点的网络构建及分析 运用Cy⁃toscape 3.7.2 软件工具 MCODE 计算获得 PPI 网络图的拓扑参数，以边相连蛋白之间有调控作用的网络中节点。本研究基于 Closeness、Degree、Radiality、Betweenness、Clustering Coefficient 等参数评估各个节点在全网络中的关键性，根据MCODE 的计算结果，Score分值越高，蛋白间相互作用可信度越高。

1.5 构建“药物-有效活性成分-核心靶点”网络图 将上述靶点基因以及药物有效化学成分和止泻散药物组成输入Cytoscape 3.7.2软件，构建“药物-有效活性成分-靶点”网络图，运用cytoNCA 插件进行分析，筛选止泻散的核心靶点。

1.6 KEGG 及GO 功能富集 将“1.2”项所获得的数据利用UniProt 数据库的Retrieve/ID mapping 搜索功能，剔除重复、非人源与不规范的靶点，经检索和转化操作最终得获取Gene Symbol，以Gene Symbol的格式导入David 6.8 数据库Functional Annotation Tool 的Upload 中粘贴筛选出的关键基因，以人类全基因组为背景和参照，分别勾选BP（biological pro⁃cess，BP）、CC（cellular component，CC）、MF（molecu⁃lar function，MF），分析结果设置阈值 EASE<0.05，Count≥4，FDR<0.01，P<0.05［13］，获得显著性较高的生物过程和通路富集的结果，点击通路名称可以链接到KEGG 数据库查看通路图及详情，并将所得信息通过R软件绘制柱状图以及气泡图。

2 结 果

2.1 止泻散中活性成分的筛选与ADME 分析 通过在TCMSP 在线数据库平台检索止泻散中所含中药活性成分及其ADME 参数，根据OB≥30%，DL≥0.18 参数对上述中药的有效活性成分进行筛选，共筛选出104个有效药物活性成分，潜在靶标数共226个。见表1。

表1 止泻散中包含中药的有效活性成分个数 （个）

2.2 止泻散中药物“活性成分-靶点网络”构建和分析 将2.1 结果中的有效活性成分及潜在靶点输入STRING 数据库中，并运用Cytoscape 3.7.2 构建止泻散的蛋白互作网络关系，见图1，此网络共178 个节点，3 252 条边，平均节点连接度为36.5，平均局部聚类系数为0.592。

2.3 构建“药物-有效活性成分-核心靶点”网络图 将上述靶点输入Cytoscape 3.7.2 软件中构建网络图，运用cytoNCA 插件进行分析，筛选核心靶点基因，根据Degree>61，Betweenness>600，LAC>100进行筛选出核心基因 MAPK8、MAPK3、JUN、VEGFA、CASP3等，见图1。将筛选的核心基因与药物有效化学成分、药物靶点组成药物-疾病-有效活性成分网络图（椭圆形代表有效活性成分、三角形代表靶点），结果发现：止泻散中药物的化学活性成分有11 个，包 括 MOL005869（daucostero_qt 胡 萝 卜 苷）、MOL000422（kaempferol 山柰酚）、MOL000273（茯苓酸）、MOL000296（hederagenin-常春藤皂苷元）、MOL000098（quercetin-槲皮素）、MOL000392（for⁃mononetin-芒柄花黄素）、MOL002311（Glycyrol-甘草酚）、MOL004328（naringenin-柚皮素）、MOL000497（licochalcone a-甘草查尔酮 A）、MOL000546（dios⁃genin-薯蓣皂苷元）等；靶点有14 个，包括VEGFA、NOS2、CASP3、JUN、NCOA2、AKT1、IL2、MAPK3、IL6、STAT3、MAPK8、MYC、IL4、EGF等。见图2。

图1 止泻散的蛋白互作网络关系图

图2 “药物-有效活性成分-核心靶点”网络图

2.4 靶点生物学功能分析 将“2.2”结果中的“活性成分-靶点”分别进行GO分析及KEGG 分析，将上述节点蛋白导入Protein name 进行注释，注释结果导入David 数据库，在 DAVID 数据库 Functional Annota⁃tion Tool 的Upload 中粘贴筛选出的关键基因，以人类全基因组为背景和参照，分析结果设置阈值：EASE<0.05，Count≥4，FDR<0.01，P<0.05，获得显著性较高的生物过程和通路富集的结果，点击通路名称可以链接到GO 数据库及KEGG 数据库查看详情。经R 语言运行后，将显著性高的生物过程和通路绘制成GO 功能富集的气泡图，P 值代表富集的显著性，相应的P 值也越小，其颜色越偏向红色，反之颜色偏向蓝色；横坐标表示富集数目；运行R 程序后，将靶点富集最多的信号通路经R 程序绘制KEGG 通路富集分析柱状图，P 值代表富集的显著性，相应的P 值也越小，其颜色越偏向红色，反之颜色偏向蓝色。GO 分析结果显示：得出10 个生物过程（biologi⁃cal process，BP），包括氧化应激、肽基酪氨酸磷酸化、对脂多糖的反应、对细菌起源分子的反应、细胞对生物刺激的反应等；10 个细胞组份（cellular compo⁃nent，CC）；包括细胞膜、细胞质、细胞核、血小板α 颗粒、RNA 聚合酶II 转录调节复合物等；10 个分子功能（molecular function，MF）；包括细胞因子活性、生长因子活性、受体配体活性、信号转导受体激活剂、蛋白酶结合、磷酸酶结合、MAP 激酶活性、胰岛素受体结合等。KEGG 富集分析结果显示，止泻散治疗效果涉及到乙型肝炎（Hepatitis B）、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染（Kaposi sarcoma-associated herpesvi⁃rus infection）、人巨细胞病毒感染（Human cytomega⁃lovirus infection）、耶尔森氏菌感染（Yersinia infec⁃tion）、沙门氏菌感染（Salmonella infection）、爱泼斯坦巴尔病毒感染（Epstein−Barr virus infection、致病性大肠杆菌感染（Pathogenic Escherichia coli infection）等与细菌感染有关的疾病，其涉及通路除MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、糖尿病并发症中的AGE-RAGE 信号通路（AGE−RAGE signaling path⁃way in diabetic complications）等通路比较明显外，另外还得到C型凝集素受体信号通路（C−type lectin re⁃ceptor signaling pathway）、MAPK 信号通路（MAPK signaling pathway）、IL-17 信号通路（IL−17 signaling pathway）、T细胞受体信号通路（T cell receptor signal⁃ing pathway）、HIF-1 信号通路（HIF−1 signaling path⁃way）、FoxO 信号通路（FoxO signaling pathway）。见图3、图4。

图3 止泻散治疗PCD的GO分析气泡图及KEGG通路分析柱状图

图4 核心靶点-通路图

3 讨 论

小儿泄泻的主要病因病机在于小儿脾常不足，脾胃虚弱，后天复感湿邪，湿邪阻滞，导致脾虚失运，水谷精微留滞肠腑，甚至肠道脂膜损伤，水湿不化，故而发为泄泻；久泻不愈则脾虚及肾，后天水谷精微不化，气血生化乏源，以致脾肾两虚［14-15］。《幼幼集成》止泻散由茯苓、山药、车前子、甘草四味药组成。临床中止泻散治疗PCD 具有良好的临床疗效，但未见有文献报道止泻散治疗PCD的作用机制研究。网络药理学不止针对单一化学成分对疾病的作用，而是融合了中医药辨证和整体的思维方法，因而对研究中药复方的作用阐释具有明显优势。

本研究筛选出了止泻散中104 个有效活性成分，潜在靶标数共226 个，构建了药物-有效活性成分-核心靶点交互网络，确定了复方中11 个有效活性成分及9 个疾病共同的核心作用靶点。随后进行GO 分析和 KEGG 富集分析，GO 分析结果显示，止泻散通过直接或间接作用于细胞膜、细胞质、血小板等多个细胞组分，通过介导细胞因子活性、生长因子活性、多种酶的结合等，参与氧化应激、肽基酪氨酸磷酸化等生物学过程。KEGG 富集分析结果显示，止泻散主要治疗与卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、人巨细胞病毒感染、耶尔森氏菌感染、沙门氏菌感染、致病性大肠杆菌感染等与细菌、病毒感染有关的疾病。提示迁延性腹泻大多与细菌感染、病毒感染相关。肠道中的厌氧菌可以抑制肠道中炎症物质的释放，减轻肠道中的炎症反应，从而增强肠道黏膜的屏障功能。儿童患迁延性腹泻时，粪便中的厌氧菌相对于正常粪便明显减少，则相应的需氧菌就会明显增多。因为小儿处于生长发育阶段，其肠道的免疫与消化功能还不完善，同时小儿肠道中微生物群也处于生理性演替阶段，使得肠道各功能不稳定，所以小儿肠道菌群紊乱容易发生，而腹泻等疾病使得肠道内厌氧菌大量减少，导致肠道屏障和拮抗作用减弱，儿童肠道免疫功能尚不完善，病原菌更容易侵袭与繁殖，从而加重腹泻的发生。止泄散治疗迁延性腹泻可能是作用于需氧菌的产生，促进厌氧菌在肠道的生长，抑制肠道中炎症物质的释放，减轻肠道中的炎症反应，从而增强肠道黏膜的屏障功能，治疗迁延性腹泻。

富集分析提示止泻散有效成分作用于靶点可能通过调节MAPK、AGE-RAGE、C 型凝集素受体、IL-17、T细胞受体、HIF-1、FoxO等信号通路来发挥治疗作用。既往研究表明，MAPK 信号通路作为重要的信号通路之一，参与介导细胞生长等生理病理过程［16］。C 型凝集素受体信号通路不仅参与免疫调节［17］，而且可以介导抗真菌感染等［18］。、IL-17 信号通路在介导调节免疫过程中成为自身免疫病研究的新方向［19］，同时又可以参与抗病毒的调节过程［20］。HIF-1 信号通路在氧化应激方面发挥重要作用［21］。在核心靶点-通路图中，MAPK3、AKT1、JUN、IL6、MAPK8、TNF、CXCL8与通路的相关性最强。由此可见，止泄散治疗迁延性腹泻可能的机制是作用于MAPK3、AKT1、JUN、IL6、MAPK8、TNF、CXCL8 等蛋白靶点，从而调节MAPK、IL-17、T细胞受体、HIF-1、FoxO 等通路，抑制肠道中炎症物质的释放，减轻肠道中的炎症反应，增强肠道黏膜的屏障功能，从而达到治疗迁延性腹泻的目的。

最后经PPI 网络分析确定复方作用于疾病的核心靶点，止泻散中包含甘草、茯苓、山药、车前子四味药，这些药物有效成分作用于疾病核心靶点的化合物包括胡萝卜苷、山柰酚、茯苓酸、常春藤皂苷元、槲皮素、芒柄花黄素、甘草酚、柚皮素、甘草查尔酮A、薯蓣皂苷元。既往研究表明，甘草的有效成分如山柰酚、槲皮素、柚皮素、甘草查尔酮A 均属于黄酮类物质，有抗炎、抗菌、调节免疫的功效［22-23］。茯苓首次记载于《神农本草经》，具有利水渗湿功效，可用于脾虚食少、便溏泄泻等症［24］，研究证实其有效成分如茯苓酸、常春藤皂苷元有抗炎、抗菌的作用［25］。山药的有效成分如薯蓣皂苷元，作为天然甾体皂苷元，具有很强的抗感染、抗过敏作用，并可消除肠道炎症［26-27］。相关研究表明车前子中多糖成分有缩短腹泻病程的功效［28］。因此，研究推测，止泻散可能通过其有效成分胡萝卜苷、山柰酚、茯苓酸、常春藤皂苷元、槲皮素、芒柄花黄素、甘草酚、柚皮素、甘草查尔酮A、薯蓣皂苷元等作用于生长因子、炎性细胞因子、多种蛋白酶等靶点，从而调控MAPK、AGERAGE、C 型凝集素受体、IL-17、T 细胞受体、HIF-1、FoxO 等信号通路发挥治疗PCD 的作用。同时也提示了止泻散多成分、多靶点和多途径治疗PCD 的作用特点，可为阐明止泻散治疗PCD 的机制提供新思路和方法。