芒果苷抑制干扰素调节因子5表达拮抗星形胶质细胞活化的实验研究

卫智权，陈柏承，陈仪新，阎 莉

（广西中医药大学，广西 南宁 530200）

阿尔茨海默病（alzheimer's disease，AD）已经成为日益困扰社会的公共卫生问题。AD 患者的数量迅速增加，不仅严重困扰AD 患者及其家人，也造成了社会卫生服务的沉重负担。2000 年至2018 年，美国死于心脏病的人数下降了7.8%，而同期死于AD的人数增加了146%，这一数字对比直观且量化地反映了有效应对AD 需要面对的严峻挑战［1］。迄今为止，对于AD 的病因仍无确切的结论，然而β 淀粉样蛋白（beta-amyloid protein，Aβ）毒性学说仍被视为AD 发病的主要原因之一。在AD 的病理过程中，神经炎症贯穿整个过程。早在AD发现之初，神经病理学家就认识到AD 患者的脑内存在明显的胶质细胞增生，在AD 转基因小鼠的脑内也广泛存在Aβ 诱导的星形胶质细胞（astrocyte）的活化，其结果就是肿瘤坏死因子 α（tumor necrosis factor α，TNF-α）等致炎细胞因子与炎症细胞趋化因子的过量产生，促进了AD的病理进程［2-3］。因此，以抑制神经炎症为靶点，从天然产物中寻找有价值的先导化合物，以此为基础研发防治AD 的药物，可能是未来AD 药物研发的有效途径［4］。

广西壮族、瑶族先民长期使用漆树科植物芒果MangiferaindicaL.的叶治疗支气管炎等炎症性疾病。研究表明，芒果苷（mangiferin）是芒果叶的主要活性成分，具有较好的抗炎活性［5-8］。芒果苷还可下调细胞内干扰素调节因子5（interferon regulatory fac⁃tor 5，IRF5）表达，显著抑制巨噬细胞循经典激活途径诱导分化为致炎表型的M1 型巨噬细胞［9］。星形胶质细胞与巨噬细胞的生物学特性具有许多相似之处［10］。作为一种重要的细胞因子，IRF5介导并维持巨噬细胞致炎表型［9］，但IRF5 对于星形胶质细胞是否也具有类似的生物学作用，以及芒果苷是否具有基于抑制IRF5 表达而拮抗Aβ 诱导的星形胶质细胞活化的药理作用，目前尚未有报道。本研究尝试以Aβ1-40体外诱导U251 人星形神经胶质细胞活化，进而探讨芒果苷基于抑制IRF5 表达而发挥抑制星形胶质细胞活化的药理作用，为芒果叶资源的开发利用提供科学依据。

1 实验材料

1.1 细胞株 U251人星形神经胶质瘤细胞株，购自中国科学院昆明细胞库。

1.2 主要试剂 芒果苷（美国Sigma 公司，批号BCBN9864V）；Aβ1-40（美 国 Sigma 公 司 ，批 号028M4864V）；DMEM 高糖细胞培养基（美国Gibco 公司，批号2085119）；胎牛血清（FBS，美国Gibco 公司，批号1828728）；磷酸盐缓冲液（PBS，美国Gibco 公司，批号8117266）；Accutase 胶原酶细胞解离液（美国 eBioscience 公司，批号 E00023-1662）；CCK-8 细胞增殖活性检测试剂盒（日本同仁化学研究所，批号DV652）；人TNF-α 酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒（武汉华美公司，批号D27014434）；组织细胞裂解液（北京索莱宝公司，批号20190903）；蛋白浓度测定试剂盒（北京索莱宝公司，批号20190910）；蛋白电泳预制胶（北京索莱宝公司，批号20190923）；Image-it⁃Fix-Permkit 细胞固定与透化试剂盒（美国Life Tech⁃nologies 公司，批号 1968179）；Nuc Blue Fixed Cell Ready Probes Reagent 细胞核4，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染料（美国 Life Technologies 公司，批号1921604）；兔抗人IRF5 单抗（美国Abcam 公司，批号GR3248905-2）；小鼠抗人磷酸甘油醛脱氢酶（GAP⁃DH）单抗（美国Abcam 公司，批号GR202362-1）；辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗兔IgG抗体（上海生工公司，批号 F902AA0024）；HRP 标记羊抗小鼠IgG 抗体（上海生工公司，批号E326AA0001）；Alexa Fluor 488 标记羊抗兔IgG 抗体（上海碧云天公司，批号102419191119）。

1.3 主要仪器 Mini-PROTEAN 型垂直电泳仪和Mini Trans-blot 型转印仪（美国 Bio-Rad 公司）；Chemi Doc 成像系统（美国Bio-Rad 公司）；5430R 小型台式高速冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；Infi⁃nite 200 Pro多功能微孔板检测仪（瑞士Tecan公司）；SP5Ⅱ激光扫描共聚焦显微分析系统（德国Leica公司）。

2 方 法

2.1 U251细胞培养 采用DMEM高糖培养基，加入终浓度 10% FBS、100 IU/ml 青霉素和 100 mg/L 链霉素。以2×105个/ml的初始细胞浓度接种于细胞培养瓶，培养条件为37 ℃、5% CO2、饱和湿度，于CO2细胞培养箱培养。待培养容器底部细胞生长面积达到70%，则进行细胞传代操作，传代周期约3 d。

2.2 芒果苷的细胞安全性测试 取对数生长期的U251 细胞，以胶原酶细胞解离液处理，获得单个U251 细胞，以 1×105个/ml 的初始细胞浓度接种于96 孔细胞培养板。设置无药物处理的为正常对照组，以及每孔加入芒果苷终浓度分别为12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L 的芒果苷各浓度处理组，各设置3 个复孔。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养24 h。继而每孔加入CCK8 工作液10 μl，继续孵育2 h。收集培养上清液，以酶标仪于450 nm 处读取各微孔的光吸收度数值。根据细胞安全性测试数据选择后续实验的芒果苷安全浓度。

2.3 Aβ1-40诱导U251 细胞活化模型的建立 取对数生长期的U251 细胞，以胶原酶细胞解离液处理，获得单个U251 细胞，以1×105个/ml的初始细胞浓度接种于96 孔细胞培养板。设置正常对照组、模型对照组（接受终浓度为20 μmol/L 的Aβ1-40孵育24 h后诱导细胞活化）［11］，各设置 3 个复孔。置于 37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养24 h。继而收集培养上清液，以ELISA检测TNF-α水平，评价建模方法的有效性。

2.4 芒果苷干预Aβ1-40诱导的U251 细胞活化 取对数生长期的U251 细胞，以胶原酶细胞解离液处理，获得单个 U251 细胞，以 1×105个/ml 的初始细胞浓度接种于96 孔细胞培养板。设置正常对照组、模型对照组（接受终浓度为20 μmol/L 的 Aβ1-40孵育24 h 后诱导细胞活化）、芒果苷干预组（接受终浓度为100 μmol/L 的芒果苷预孵育12 h，再接受终浓度为20 μmol/L 的Aβ1-40孵育24 h 后诱导细胞活化），各设4 个复孔。置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度的细胞培养箱中，继续培养24 h。继而收集培养上清液，以 ELISA 检测 TNF-α 水平；每组收集 3 个复孔的细胞，用于蛋白免疫印迹（western blotting，WB）检测细胞IRF5 的表达水平；余下1 个复孔用于激光扫描共聚焦显微分析细胞IRF5原位表达情况。

2.5 激光扫描共聚焦显微分析细胞IRF5 表达 仔细吸除96 孔细胞培养板的培养液，PBS 洗3 次。以Image-itFix-Permkit 进行细胞固定与透化，加入1∶500 稀释的兔抗人 IRF5 单抗，4 ℃避光孵育过夜。仔细吸除一抗孵育液，PBS 洗3 次，加入Alexa Fluor 488 标记羊抗兔IgG 抗体（稀释度1∶1 000），25 ℃避光孵育2 h。仔细吸除二抗孵育液，PBS 洗3次，加入细胞核 DAPI 染料，25 ℃避光孵育 15 min。PBS 洗 3次，以SP5Ⅱ激光扫描共聚焦显微分析系统成像。

2.6 WB 检测细胞IRF5 表达 仔细吸除96 孔细胞培养板的培养液，PBS 洗3 次，加入适量4 ℃预冷的PBS，1 000 r/min离心5 min。小心去除上清液，加入10倍体积组织细胞裂解液，立即置于4 ℃孵育20 min，而后12 000 r/min 离心5 min，取上清液。准备蛋白电泳预制胶，上样量为每孔20 μg总蛋白。垂直电泳条件为恒压100 V，指示剂泳动至凝胶中下部时停止。采用湿法转膜，4 ℃一抗孵育过夜，IRF5 单抗、GAPDH 单抗稀释倍数均为1∶1 200。一抗孵育结束，1∶3 000 稀释的二抗室温孵育 60 min，ECL 超敏化学发光液孵育3 min，即以Chemi Doc 成像系统测定并计算目的蛋白IRF5 与内参蛋白GAPDH 条带灰度的比值，作为蛋白的相对表达水平。

2.7 统计学处理 采用SPSS 12.0 统计软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（）表示，方差齐性数据采用独立样本t检验（两组间均数比较）或单因素方差分析LSD 检验（多组间均数比较），方差不齐数据采用秩和检验。以P<0.05 为差异具有统计学意义。

3 结 果

3.1 芒果苷对U251细胞的安全性测试结果 见表1。与未经药物处理的正常对照组比较，12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 的芒果苷孵育对于细胞的增殖活性无明显影响，而200 μmol/L 的芒果苷孵育可降低细胞增殖活性（P<0.01）。故选择100 μmol/L为后续细胞实验的芒果苷适宜浓度。

表1 芒果苷的细胞安全性测试结果 （）

表1 芒果苷的细胞安全性测试结果 （）

注：与正常对照组比较，①P<0.01

组 别正常对照组芒果苷12.5 μmol/L浓度组芒果苷25 μmol/L浓度组芒果苷50 μmol/L浓度组芒果苷100 μmol/L浓度组芒果苷200 μmol/L浓度组n3 3 3 3 3 3药物浓度（μmol/L）0 12.5 25 50 100 200细胞安全性（%）100.00±17.26 99.85±8.63 101.32±1.44 103.23±4.88 101.49±1.99 93.01±1.54①

3.2 Aβ1-40诱导U251 细胞活化模型的建立与验证 模型对照组培养上清液中的TNF-α水平为（127.60±8.19）pg/ml，显著高于正常对照组的（60.01±4.52）pg/ml，两组间差异具有统计学意义（P<0.01）。

3.3 芒果苷对Aβ1-40诱导的U251 细胞活化与IRF5蛋白表达的影响 见表2、图1。模型对照组培养上清液中的TNF-α 水平及IRF5 蛋白表达水平显著高于正常对照组（P<0.01）；与模型对照组比较，100 μmol/L 芒果苷预处理后明显降低了培养上清液中的 TNF-α 水平及 IRF5 蛋白表达水平（P<0.05 或P<0.01）。

表2 芒果苷干预对Aβ1-40诱导的U251细胞活化及IRF5蛋白表达的影响 （）

表2 芒果苷干预对Aβ1-40诱导的U251细胞活化及IRF5蛋白表达的影响 （）

注：与正常对照组比较，①P<0.01；与模型对照组比较，②P<0.05，③P<0.01

组 别正常对照组模型对照组芒果苷100 μmol/L浓度组n3 3 3 TNF-α（pg/ml）52.21±1.24 122.54±0.90①73.15±0.30③IRF5蛋白表达0.54±0.12 0.98±0.09①0.73±0.04②

图1 各组细胞IRF5蛋白条带表达图

3.4 芒果苷对Aβ1-40诱导的U251 细胞IRF5 蛋白原位表达的影响 激光扫描共聚焦显微分析IRF5 原位表达的结果与WB检测一致，见图2。

4 讨 论

多项研究发现，神经炎症在AD病理进程的极早期即已出现，而此时尚未观察到明显的Aβ斑块和神经纤维缠结（neurofibrillary tangles，NFTs），此现象表明神经炎症是导致Aβ 斑块与NFTs 形成的重要原因，也是AD病理进程中不依赖于Aβ斑块与NFTs触发的主动病理反应［12-13］。中枢神经系统的免疫细胞种类与外周循环以及其他脏器有所不同，在血脑屏障形态与功能相对完整的情况下，外周循环的巨噬细胞与淋巴细胞等免疫细胞不能穿透血脑屏障进入中枢神经系统。中枢神经系统固有的小胶质细胞与星形胶质细胞承担了与巨噬细胞类似的吞噬、处理病理性抗原的功能，因此，星形胶质细胞是参与神经炎症的主要炎症细胞之一。星形胶质细胞表面的模式识别受体可为Aβ寡聚体及神经炎性斑块激活，进而激活下游的丝裂原活化蛋白激酶细胞信号转导途径，引起病理性炎症损伤，因此，参与神经炎症的星形胶质细胞可以与AD病理进程产物Aβ构成相互促进的闭环系统，从而实现神经炎症与AD的自身循环加强过程［14］。中枢神经系统中星形胶质细胞的数量远超小胶质细胞，因而其发挥的促神经炎症作用无法忽视。活化的星形胶质细胞表达高水平的趋化因子CXCL10，而高水平的趋化因子CXCL10 进一步诱导星形胶质细胞向Aβ斑块迁移和聚集，维持并不断扩展神经炎症、Aβ 斑块的范围［15］。此外，活化的星形胶质细胞产生大量促炎细胞因子、炎症介质以及小分子信号因子，如TNF-α、白细胞介素1β、γ-干扰素、一氧化氮等，可进一步诱导Aβ 的产生和沉积，进而发挥强而持续的神经细胞毒作用［16］。上述恶性循环导致炎症反应不断加重、Aβ 沉积增多和神经细胞损伤，加速了AD 进程。上述研究结果表明，星形胶质细胞活化导致的神经炎症机制与其他机制相互联系，共同损伤神经细胞，促进AD 进展。Aβ的持续刺激会使星形胶质细胞释放大量炎症因子，如白细胞介素1β、γ-干扰素、TNF-α 等加重炎症反应，损伤神经细胞，促使Aβ 沉积；所释放的炎症因子反过来又激活更多星形胶质细胞形成炎症级联反应，从而导致AD 不断恶化［17-18］。此外，活化的星形胶质细胞的病理产物，例如大量促炎细胞因子、趋化因子、炎症介质以及小分子信号因子，强烈促进神经细胞的骨架蛋白的重要成分Tau 蛋白的磷酸化过程，导致Tau蛋白的过度磷酸化；过磷酸化的Tau蛋白的空间构象发生较大改变，与细胞微管结构的亲和力明显降低，极易从细胞微管解离而转为游离态Tau蛋白；过磷酸化的游离态Tau 蛋白的溶解性显著降低，在分子斥力的推动下互相聚合，进而形成NFTs［19-20］。由上可知，活化星形胶质细胞参与的神经炎症直接促进了Aβ 沉积、NFTs、神经细胞损伤的发生与发展，是导致AD 进行性恶化的重要因素。

天然产物是研发治疗AD 或延缓其进展的药物的重要来源，已有从植物、微生物和海洋动植物中寻找防治AD 的有效成分的相关报道［21-22］。中国学者从千层塔中开发的胆碱酯酶抑制剂石杉碱甲，已经用于AD 临床治疗［23］。芒果苷具有显著的抗炎作用，其抗炎作用的药效机制呈现多靶点、多途径的特征，具备成为抑制神经炎症的候选天然产物的潜质。本研究中，Aβ1-40体外可以成功诱导U251 人星形神经胶质细胞活化，显著增加其释放的TNF-α 数量，明显上调细胞IRF5表达水平，提示IRF5在介导并维持Aβ 诱导的星形胶质细胞活化的过程中扮演了重要角色。实验结果表明，安全浓度的芒果苷预处理后可明显抑制Aβ1-40诱导的星形胶质细胞活化效应，显著下调细胞IRF5 表达水平，进一步佐证了IRF5 表达水平与星形胶质细胞活化密切相关的推测，也提示下调IRF5 表达或许是芒果苷发挥抑制星形胶质细胞活化的重要作用机制。

本研究表明，IRF5 可能是调节星形胶质细胞活化的潜在药物作用靶点，具有进一步深入研究的价值。鉴于芒果苷的良好抗炎活性与生物安全性，下一步应开展动物体内实验，以验证芒果苷抑制Aβ诱导的星形胶质细胞活化的体内活性，为芒果苷在神经退行性疾病防治领域的合理应用、药物作用的分子机制提供更丰富的理论依据和实验基础。