SPME-GC-MS分析与鉴别青海亚麻籽油挥发性组分

韩玉泽，王兴瑞，李应霞，王淑珍，陈昀昀，王进英,2,

（1.青海大学农牧学院，青海西宁 810016；2.青海大学，三江源生态与高原农牧业国家重点实验室，青海西宁 810016）

亚麻又称胡麻，是一种特色的油料作物。亚麻作为我国五大油料作物之一，在我国种植面积广，主要分布在华北、西北等高寒地区，是河北、甘肃、新疆、青海等地的特种油料作物。亚麻籽中含有对人体有益的α-亚麻酸、蛋白质、膳食纤维、酚类物质等多种功能成分[1]，在预防心血管疾病和癌症，降低骨吸收率、抗炎、抗抑郁等多方面均具有重要作用[2−4]。

亚麻籽油具有独特的风味，其风味成分是影响感官特性、品质的重要因素，快速、准确地分析亚麻籽油中的挥发性成分，可为亚麻籽油的品质控制、进一步优化加工贮藏条件提供理论依据[5−6]。目前，国内外对食品中风味物质的萃取方法主要包括溶剂萃取法、同时蒸馏萃取法[7]、超临界流体萃取[8]、顶空固相微萃取[9−11]等。顶空固相微萃取是一种针对样品挥发性成分进行采集的新型技术，它将被分析物从样品基质中吸附到纤维上，然后被解吸到分析仪器中进行分析，具有费用低、操作简单、准确性高、节约样品制备时间等优点[12]。近年来，SPME-GC-MS被广泛应用于多种植物油香气成分的分析鉴别。Dierkes等[13]对95个不同品质的橄榄油风味成分进行分析，共得到21种香气物质。于文龙等[14]研究了不同加工工艺的亚麻籽油中挥发性物质构成，检测出热榨亚麻籽油特征香气成分16种，冷榨亚麻籽油挥发性成分14种，共有香气成分7种。杨柳等[15]采用顶空结合气质联用对油茶籽油、大豆油、菜籽油等食用油挥发性成分进行鉴别，发现不同植物油均有其特征性挥发性组分且对其检测效果良好。大量研究表明，SPME是植物油挥发性物质较为合适的萃取方法。

本实验以青海本地亚麻籽为研究对象，通过对固相微萃取条件优化，并结合气质联用分析亚麻籽油中挥发性成分的组成，建立了青海亚麻籽油风味物质最佳检测方法，为亚麻籽油品质鉴定与分析提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

青海亚麻籽 40种，由实验室索氏抽提（料液比0.06 g/mL、抽提温度70 ℃，抽提时间8 h）制得亚麻籽油，编号S1~S40，具体信息见表1。

表1 亚麻籽油信息表Table 1 Information of flaxseed oil

QP 2020 NX GC-MS联用仪 日本岛津公司；50/30 μm二乙烯基苯/碳分子筛/聚二甲基硅氧烷（DVB/CAR/PDMS）萃取纤维头、固相微萃取手柄、SPME专用磁力加热搅拌装置、15 mL采样瓶 美国Supelco；JA1003电子天平 上海良平仪器仪表有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 挥发性成分的萃取 实验方法参照文献[11]进行，将萃取头置于260 ℃进样口老化60 min，直至无干扰峰出现。取6.0 g青海亚麻籽油置于15 mL采样瓶中，放入磁力搅拌子后立即用带有聚四氟乙烯硅胶隔垫的盖子将其密封压紧，将样品瓶置于80 ℃磁力加热搅拌器上，以400 r/min的速率搅拌加热20 min，使亚麻籽油挥发性组分充分平衡，之后将活化好的萃取头穿过硅胶隔垫，推出纤维头，顶空萃取40 min。迅速将萃取头插入气相色谱进样口，250 ℃条件下解吸5 min。每两次进样分析间需将萃取头置于250 ℃进样口洗脱10 min，以保证纤维头的高效性。

1.2.2 色谱条件 色谱柱：InertCap pure-wax色谱柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升温程序：40 ℃保持2 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。高纯氦气（99.999%）流速1.0 mL/min，分流比50:1，进样口温度250 ℃。

1.2.3 质谱条件 电子轰击（EI）电离源；电子能量70 eV；传输线温度为260 ℃；离子源温度150 ℃；灯丝发射电流200 μA；质量扫描范围m/z 35~350 amu。

定性定量：挥发性成分通过NIST谱库进行检索，与标准物质谱图分析对比进行定性分析，当相似度>80%时，确定为该物质。采用面积归一化法，依据峰面积分析各组分的相对百分含量。

1.2.4 SPME条件的优化

1.2.4.1 搅拌速率的确定 选用DVB/CAR/PDMS作为萃取头，固定条件为：萃取温度70 ℃、平衡时间30 min、吸附时间40 min、解吸时间5 min，考察搅拌速率0、200、400、600、800 r/min对青海亚麻籽油挥发性成分萃取效果的影响。

1.2.4.2 萃取温度的确定 选用DVB/CAR/PDMS作为萃取头，固定条件为：搅拌速率400 r/min、平衡时间30 min、吸附时间40 min、解吸时间5 min，比较萃取温度50、60、70、80、90 ℃对青海亚麻籽油挥发性成分萃取效果的影响。

1.2.4.3 平衡时间的确定 选用DVB/CAR/PDMS作为萃取头，固定条件为：搅拌速率400 r/min、萃取温度80 ℃、吸附时间40 min、解吸时间5 min，比较平衡时间10、20、30、40、50 min对青海亚麻籽油挥发性成分萃取效果的影响。

1.2.4.4 吸附时间的确定 选用DVB/CAR/PDMS作为萃取头，固定条件为：搅拌速率400 r/min、萃取温度80 ℃、平衡时间20 min、解吸时间5 min，比较吸附时间20、30、40、50、60 min对青海亚麻籽油挥发性成分萃取效果的影响。

1.2.4.5 解吸时间的确定 选用DVB/CAR/PDMS作为萃取头，固定条件为：搅拌速率400 r/min、萃取温度80 ℃、平衡时间20 min、吸附时间40 min，比较解吸时间1、3、5、7、9 min对青海亚麻籽油挥发性成分萃取效果的影响。

1.2.5 升温程序的优化 为使各目标物更好的分离，选用植物油挥发性成分测定常用的wax色谱柱，参考文献[11]对升温程序进行优化。

1.2.6 样品聚类分析 将40批样品的挥发性成分作为变量，导入SPSS23.0数据分析软件中，选取组间连接法，以欧式距离为标准对样品进行聚类分析。

1.3 数据处理

采用Microsoft Excel及SPSS23.0对数据进行处理、统计；用Origin 2018软件分析所有数据并绘制图表；各实验重复3次。

2 结果与分析

2.1 SPME条件的优化

2.1.1 搅拌速率对萃取效果的影响 搅拌可以加速食用油中挥发性成分的挥发与吸附，因此在亚麻籽油顶空固相微萃取的过程中使用磁力加热搅拌器以减少萃取时间，使挥发性成分更快达到萃取平衡。由图1可以看出，搅拌速率从0增至800 r/min的过程中，峰个数与总峰面积均呈现先上升后下降的趋势。随着搅拌速率增大，不仅加快了样品中待测物由液相向气相的扩散速率，同时增大了亚麻籽油中含量少及挥发性低的挥发物的挥发度。当搅拌速率为400 r/min时峰个数与总峰面积均达到最大值，说明在该搅拌速率下样品中挥发性成分达到平衡状态。继续增大搅拌速率萃取效果反而变差，可能是由于过高的搅拌速率导致磁力搅拌子不稳定，因此选择400 r/min为最佳搅拌速率。

2.1.2 萃取温度对萃取效果的影响 SPME对食用油中挥发性成分的提取与富集是一个动态平衡过程。随着萃取温度的升高，分子运动速度加快，进而使样品中挥发性成分的扩散系数增大，缩短了萃取时间。当温度过高时，样品分配系数减少，降低了萃取头对挥发性成分的吸附，降低萃取效率[16]。由图2可以看出，随萃取温度升高，峰个数不断增加，但是总峰面积在萃取温度80 ℃达到最高点后反而开始下降，分析其原因可能是在过高温度下，样品发生变质，脂肪酸分解生成一定数量的低分子氧化产物，与风味物质竞争顶部空间导致峰面积下降[16]。同时，顶空固相微萃取吸附过程属于放热反应[17]，在过高的温度下不利于样品中挥发性成分的吸附。综合考虑，选择80 ℃为最佳萃取温度。

图2 萃取温度对萃取效果的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction effect

2.1.3 平衡时间对萃取效果的影响 由图3可知，在平衡时间内，挥发物种类与总峰面积呈先升高后降低的趋势，这表明一定的平衡时间可以使更多的挥发物从样品中释放出来，在平衡时间20 min时检测出样品中挥发性成分最多有57种，由于挥发性成分的释放与溶解呈动态平衡过程，继续增加平衡时间会使释放出的挥发物重新溶解，导致挥发物总量下降[18]，因此当平衡时间为20 min时，挥发物的释放程度最大，具有最佳的萃取效果。

图3 平衡时间对萃取效果的影响Fig.3 Effect of equilibration time on the extraction effect

2.1.4 吸附时间对萃取效果的影响 由图4可知，吸附时间20~40 min之间，峰个数与总峰面积均呈上升趋势，在40 min时达到最大值，吸附时间延长峰个数与总峰面积反而开始缓慢下降。说明在一定的时间内，随着萃取时间延长，可检出的样品中的香气成分增加，同时峰面积增大，但是过长的萃取时间会导致已经吸附在萃取头上的目标物重新解析出来，从而造成萃取量的降低，综合考虑，最佳的萃取时间为40 min。

图4 吸附时间对萃取效果的影响Fig.4 Effect of adsorption time on extraction effect

2.1.5 解吸时间对萃取效果的影响 待样品中挥发性成分完全吸附到萃取头上后，将萃取头插入250 ℃的GC进样口进行解吸。时间过短不能将挥发性成分从萃取头上完全解吸下来，影响检测结果的准确性，同时也会对下一样品产生污染。当解吸时间过长，萃取头长时间处于高温环境中会缩短其寿命。由图5可知，解吸时间为1~5 min内，挥发物的种类及总峰面积呈上升趋势，5 min以后则趋于平缓，说明解吸时间5 min时目标物基本解吸完全。故选5 min作为最佳萃取时间。

图5 解吸时间对萃取效果的影响Fig.5 Effect of desorption time on extraction effect

2.2 升温程序的选择

在萃取条件优化的基础上对GC-MS升温程序进行优化，以使各目标物更好地分离，同时得到理想峰型。试验探究了以下两个升温条件对分离效果的影响：升温程序A：初温36 ℃，保留5 min，以3 ℃/min升至100 ℃，保持5 min，以8 ℃/min升至180 ℃，保持10 min。升温程序B：初温40 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至220 ℃，保持10 min。

如图6所示，各目标物在升温程序A、B的条件下进行升温操作，整个升温过程在50 min左右，在这个时间段，两个程序都可以使目标物得到较好地分离，由于程序B升温速率较快，目标物在38 min之前基本全部出峰，同时目标物在较高温度下出峰，得到的峰型理想。此外，相比程序B，程序A中最后的目标物由于是在较低的温度下出峰，因此使得整个峰高较低。综上，升温程序B效果好于升温程序A。

图6 不同升温程序下亚麻籽油挥发性成分的总离子流图Fig.6 Total ion chromatograms of volatile components of linseed oil under different heating programs

2.3 青海亚麻籽油挥发性组分分析

挥发性香气成分是评价植物油品质的重要指标，对植物油整体香气起着重要作用[19]。以优化后的SPME条件萃取青海亚麻籽油中挥发性成分，经GC-MS检测初步鉴定出青海40种浸提亚麻籽油含有挥发性成分共58种，主要包括醛类、酸类、醇类、酮类、酯类、烷烯类、杂环类、其他类物质。如表2所示，从各品种挥发性成分的主要构成看，醛类和烷烯类化合物数量最多，相对含量也最高，最高分别占总挥发性成分的54.82%和53.75%。酸类、醇类化合物数量分别为8、9种，其相对含量最高分别为26.03%、8.16%。酮类、酯类、杂环类种类较少，分别含有2、5、3种。由于醛类挥发性成分的风味阈值相对较低，且大多数的醛类物质具有较强的香气，因此，醛类化合物对青海亚麻籽油整体风味起主导作用；烷烯类化合物是主要存在于植物性食品中具有植物固有的清香的一类物质，但其性质不稳定且阈值较高，因而对亚麻籽油风味贡献不大；同时相对含量较低的醇类、酯类也因其阈值较高，而对亚麻籽油风味贡献较低。

表2 不同类别亚麻籽油挥发性成分的相对含量（%）Table 2 Relative content of volatile components in different classifications of flaxseed oil (%)

植物油中的挥发性成分生成途径主要包括美拉德反应和脂质氧化，美拉德反应生成呋喃、吡嗪、吡咯等，脂质氧化生成醛、酮等物质[20]，由于样品是通过索氏抽提制取的亚麻籽油，因此美拉德反应程度较低，多数挥发性成分是由于脂肪酸氧化而产生，可以发现亚麻籽油的风味贡献物质主要是醛类物质中的反-反-2,4-庚二烯醛，其是亚麻酸的主要氧化产物，具有脂肪、水果香等香气。该挥发性成分几乎存在于各品种中，且相对含量较高，在40个样品中的平均含量达到11.03%，因此被认为是亚麻籽油的特征风味物质，这与王笑园等[21]的研究结果一致。同时，油脂氧化生成的短链次生氧化产物也会产生不愉快的气味，进而影响亚麻籽油的整体风味。

2.4 青海亚麻籽油挥发性成分聚类分析

植物油风味主要取决于样品的品种、成熟度、种植区域、气候条件、加工工艺、贮藏条件[22−23]。运用SPSS 23.0软件，采用组间连接对40个青海亚麻籽油样品进行聚类分析，以平方欧氏距离为度量标准得到青海亚麻籽油挥发性成分组成的聚类谱系图。

由图7知，通过聚类分析可以较好地将40种青海亚麻籽油样品区分开。欧氏距离可以表征样品的相似度，欧氏距离越小表明样品的相似度越高可归为一类[24]。当距离为20时，所有样品可以聚为两大类，S35单独一类，其余样品为一类；当类间距离为10时，亚麻籽油样品可以聚为三大类，S35为一类，S22、S37、S39、S40可归为一类，其余35个样品聚为一类，表明以挥发性组分为指标进行聚类分析可以将40批亚麻籽油样品进行区分。

图7 40个亚麻籽油样品聚类谱系图Fig.7 Cluster pedigree map of 40 flaxseed oil samples

结合表2可以发现，S35中挥发性成分种类极少，使得烷烯类与杂环类的相对百分含量明显高于其他样品，与其他样品有较大差距；4个样品（S22、S37、S39、S40）中醛类物质具有较高的相对含量，因此被单独聚为一类。分析原因可能是此类样品中亚麻酸、亚油酸含量较高，而醛类物质通常是由亚油酸、亚麻酸氧化生成，故其含量高于其他品种。

3 结论

本研究比较了搅拌速率、萃取温度、平衡时间、解吸时间、吸附时间五个因素对青海亚麻籽油挥发性成分数量及峰面积的影响，结果表明当搅拌速率400 r/min、萃取温度80 ℃、平衡时间20 min、吸附时间40 min、解吸时间5 min时萃取效果最好。

采用优化后的HS-SPME-GC-MS条件检测并结合聚类分析对青海40种亚麻籽油中挥发性成分进行分析比较。结果表明，40种青海亚麻籽油样品中共检测出58种挥发性成分，包括醛类12种，酸类8种，醇类9种，酮类2种，酯类5种，烷烯类13种，杂环类3种，其他类6种。醛类物质对亚麻籽油整体风味具有突出作用，其中反-反-2,4-庚二烯醛是亚麻籽油的特征风味物质。

根据聚类分析可知，40个品种可以分为3个类群，同一类群之间挥发性成分组成类似，不同类群之间存在差异，可能与亚麻籽油品种、成熟度、种植条件相关。同时，由于脂肪氧化对亚麻籽油风味的形成起到重要作用，因此有必要进行后续试验，分析亚麻籽油中脂肪酸含量及组成与脂质氧化形成挥发性成分的关系。该研究结果对青海亚麻籽油特征风味物质及其开发利用提供了一定的理论依据。