超声微波协同制备粗毛纤孔菌多糖及体外降脂作用的研究

赵有伟，李德海

（东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨 150040）

随着生活质量的提高，人们日常生活中对高脂、高糖、高能量饮食的摄入增加，导致高血脂症患病人群数量增加，高血脂症已成为世界关注的重点问题[1]。预防与治疗高脂血症的方法有运动锻炼、控制饮食和药物治疗等方式，其中药物治疗方式效果虽好，但是有毒副作用[2]。有研究表明天然产物中含有许多降血脂的物质，从天然产物中开发降血脂的物质成为当今研究热点[3]。

粗毛纤孔菌Inonotus hispidus（Bull.）Pat.，又名粗毛黄褐孔菌，是一种非常珍贵的药用真菌[4]。粗毛纤孔菌作为一种药用真菌，具有抗肿瘤[5]、抑菌[6]、抗氧化[7]、降血脂[8]、提高免疫力[9]等生物活性。目前已经从粗毛纤孔菌中分离得到多种具有生物活性的化合物，包括多糖类[10]、三萜类[11]和酚类[12]等。多糖作为粗毛纤孔菌中的主要活性成分，具有提高免疫力、抗肿瘤、抗氧化、降血糖等作用[13−14]。但提取方法对有效活性成分的提取效果以及活性的影响很大[15]。张倩等[16]研究热水浸提和超声微波协同提取对枸杞多糖的提取率和抗氧化活性影响，结果表明超声微波协同法得到的枸杞多糖提取率显著高于热水浸提法，且超声微波协同法得到的多糖对自由基的清除能力比热水浸提法更好。苏平等[17]研究四种不同辅助提取方法对黄秋葵花多糖的提取率和抗氧化活性的影响，四种方法对比发现酶法提取的黄秋葵花多糖提取率最高，四种方法提取的多糖抗氧化活性效果不同，超声辅助提取的多糖表现出更强的抗氧化活性。马舒伟等[18]研究不同方法对玄参多糖单糖组分和抗氧化活性的影响，不同方法提取的玄参多糖对比发现，酶辅助提取法提取的玄参多糖的纯度最高，体外抗氧化活性最强。

超声微波协同辅助提取法充分利用了超声波震动的空化作用与微波的高能效应和热效应，将超声微波相结合，既能缩短提取时间，又可以提高提取效率，从而实现高效快速的处理样品[19]，有学者采用微波超声组合提取猴头菇多糖与热水提取法、超声波提取法和微波提取法相比，发现微波超声联用组合具有节省时间和多糖浸出率高等优点[20]。因此为提高粗毛纤孔菌多糖的提取率，本文采用Box-Behnken试验设计研究了超声微波协同制备粗毛纤孔菌多糖的工艺，并与微波辅助提取法和热水提取法对比分析了粗毛纤孔菌多糖提取率及体外胆酸盐结合能力，以期为把粗毛纤孔菌多糖开发成为一种降脂功能性食品提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

粗毛纤孔菌子实体 于2020年9月采自东北林业大学林场；葡萄糖、浓硫酸、苯酚 国产分析纯；甘氨胆酸钠、牛磺胆酸钠、胃蛋白酶（1:3000）、胰蛋白酶（1:250） 上海源叶生物生物科技有限公司。

Scientz-IIDM型微波光波超声波萃取仪 宁波新芝生物科技股份有限公司；FW100型高速万能粉碎机 天津市泰斯特仪器有限公司；722s型紫外分光光度计 上海第三分析仪器厂；RE-52型旋转蒸发器 上海亚荣生化仪器公司；SHB-Ⅲ型循环水真空泵 郑州长城科工贸有限公司；GL10048型万分之分析天平 上海佑科仪器仪表有限公司；TDL40BW型台式离心机 上海星科科学仪器有限公司；HH-4型电热恒温水槽 上海力辰仪器科技有限责任公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料处理 将采摘的新鲜粗毛纤孔菌子实体于烘箱中60 ℃烘干，高速粉碎机粉碎，过60目筛，备用。

1.2.2 超声微波协同制备粗毛纤孔菌子实体多糖工艺

1.2.2.1 单因素实验 准确称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，加入一定体积的蒸馏水，充分搅拌后放置微波光波超声波萃取仪中，固定实验参数料液比1:30 g:mL，超声时间30 min，超声功率200 W，微波时间30 s，微波功率300 W，分别考察料液比（1:10、1:20、1:30、1:40、1:50 g:mL），超声时间（10、20、30、40、50、60 min）、超声功率（100、200、300、400、500 W）、微波时间（10、20、30、40、50、60 s）、微波功率（100、200、300、400、500、600 W）对超声微波辅助提取粗毛纤孔菌多糖提取率的影响，将制备得到的多糖提取液在4000 r/min离心15 min，上清液即为粗毛纤孔菌子实体多糖溶液，残渣按上述步骤复提两次，合并提取液。在旋转蒸发仪上60 ℃旋转蒸发至原体积的1/4，冷却后测多糖含量。得出五个单因素对IHP提取率的影响，最终根据单因素实验结果确定响应面试验的因素和水平。

1.2.2.2 响应面设计 根据单因素的实验结果，使用Design-Expert8.0软件进行响应面试验设计，因素水平表见表1。根据响应面试验结果，建立数学模型，确定IHP的最佳提取条件。

表1 响应面设计因素水平及编码Table 1 Factors, levels and coding for response surface design

1.2.3 不同提取方法对粗毛纤孔菌多糖提取率的影响将优化后的超声微波辅助法对IHP的提取率与热水浸提法和超声辅助法进行对比。超声微波辅助提取法：称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸馏水，充分搅拌后，置于放置微波光波超声波萃取仪中，设定超声时间51 min，超声功率200 W，微波时间50 s，微波功率500 W进行提取，离心取上清液，测多糖含量。热水浸提法和超声辅助法采用预实验优化得到的工艺条件。热水浸提法：称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸馏水，充分搅拌后，60 ℃水浴浸提3 h，提取结束后，离心取上清液，测多糖含量。超声辅助法：称取一定量的粗毛纤孔菌干粉于三角瓶中，按料液比1:30加入蒸馏水，充分搅拌后，置于放置微波光波超声波萃取仪中，设置超声功率200 W，超声时间1 h，提取结束后，离心取上清液，测多糖含量。

1.2.4 粗毛纤孔菌多糖含量的测定

1.2.4.1 葡萄糖标准曲线的制作 采用苯酚-硫酸法测定糖含量[21]准确称取经真空干燥恒重的葡萄糖40 mg，于500 mL容量瓶中定容配制成80 μg/mL的葡萄糖标准液，取2.0 mL蒸馏水为空白样，用移液枪依次吸取0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 mL葡萄糖标准液于具塞试管，各管补加蒸馏水至2.0 mL，加入6%苯酚1 mL，98%浓硫酸5 mL，静置10 min后振荡混匀，室温下静置20 min后，充分反应，于490 nm下测定OD值，以葡萄糖含量（μg/mL）为横坐标，OD值为纵坐标作葡萄糖标准曲线。得到的线性回归方程y=0.0146x+0.3004，R2=0.9931，可以用于计算多糖含量。

1.2.4.2 多糖含量的测定 准确吸取2 mL已提取好的IHP溶液，加入6%苯酚1.0 mL和98%浓硫酸5.0 mL，静置10 min后振荡混匀，在室温下放置20 min，于490 nm下测定OD值。若测得样品多糖浓度不在测量范围内，应当稀释再次测量。粗毛纤孔菌多糖的提取率为提取液中的多糖与总多糖的比值，在预实验中，采用热水法反复多次提取确定了粗毛纤孔菌子实体多糖含量为16.4%。提取率计算公式为：

式中：C为根据标准曲线计算得到的粗毛纤孔菌水提液液所含多糖的质量浓度，μg/mL；V为粗毛纤孔菌水提液总体积，mL；N为溶液最终的稀释倍数；k为粗毛纤孔菌子实体粉末的重量，g；m为1 g粗毛纤孔菌子实体粉末总多糖含量，%。

1.2.5 体外降脂实验

1.2.5.1 胆酸盐标准曲线的绘制 胆酸盐测定方法参照文献[22]分别取不同浓度的胆酸盐标准溶液（甘氨胆酸钠0.03、0.06、0.12、0.18、0.24、0.3 mmol/L，牛磺胆酸钠0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3 mmol/L），2 mL于具塞试管中，向每管标准溶液中依次加入6 mL质量分数60%的H2SO4，70 ℃恒温水浴锅中水浴20 min，取出后进行冰浴5 min，在387 nm处测定吸光度，分别作两种胆酸盐标准曲线，计算回归方程，牛黄胆酸钠的回归方程为y=2.8591x−0.0176，R2=0.9957，可以用于计算牛磺胆酸钠含量。甘氨胆酸钠的回归方程为y=1.5012x+0.0536，R2=0.9957，可以用于计算甘氨胆酸钠含量。

1.2.5.2 粗毛纤孔菌多糖胆酸盐结合能力的测定粗毛纤孔菌多糖提取液以1:3的比例加入95%乙醇，4 ℃醇沉24 h，离心，去除上清液，沉淀即为粗毛纤孔菌粗多糖，将粗多糖用蒸馏水配制成20 mg/mL多糖溶液分别吸取1 mL粗毛纤孔菌粗多糖溶液于100 mL具塞三角瓶中，加入1 mL10 mg/mL胃蛋白酶，3 mL 0.01 mol/L的HCl溶液，在37 ℃恒温振荡，模拟胃环境（pH为1.5）消化1 h；以0.1 mol/L的NaOH溶液调节溶液pH至6.3，再加入4 mL10 mg/mL胰蛋白酶，模拟肠道环境进行消化1 h，加入4 mL 1 mmol/L胆酸盐消化1 h，4000 r/min离心20 min，取上清液，比色测定胆酸盐含量，平行3次实验。甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠结合率按下式计算。

式中：c1为甘氨胆酸钠加入量，μmol，c2为甘氨胆酸钠剩余量，μmol，c3为牛磺胆酸钠加入量，μmol，c4为牛磺胆酸钠剩余量，μmol。

1.3 数据处理

实验重复三次，试验中的数据运用SPSS17.0软件进行方差分析（analysis of variance，ANOVA）单因素方差分析，数据以表示，组间做t检验，P<0.05则表示有显著性差异，有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对IHP提取率的影响 由图1可知，IHP提取率随料液比的增加而提高，其中当料液比在小于1:30 g:mL时，IHP提取率随料液比比例的增加而显著提高（P<0.05），当料液比大于1:30 g:mL时，IHP提取率增加不显著（P>0.05）。当料液比小于1:30 g:mL时，由于提取溶剂的量过少，IHP提取液中多糖处于饱和状态，粗毛纤孔菌中的多糖无法进一步溶出，此时随着提取溶剂量的增加，多糖不断溶出，提取率也在增加。但是当料液比大于1:30 g:mL时，粗毛纤孔菌中多糖已经大量溶出至提取溶剂中，而提取溶剂中多糖也没有达到饱和状态，因此即使增加提取溶剂用量，IHP提取率变化不大[23]，差异性不显著（P>0.05），所以选取最佳料液比为1:30 g:mL。

图1 料液比对IHP提取率的影响Fig.1 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction rate of IHP

2.1.2 超声时间对IHP提取率的影响 由图2可知，IHP的提取率随超声波作用时间的增加而增加，主要是由于超声波作用时间增加，粗毛纤孔菌细胞破裂，多糖不断溶出，在50 min时达到最大值，60 min多糖的提取率略微降低，可能原因是超声波作用时间过长对多糖的结构会产生影响，会导致多糖降解，影响多糖的生物活性[24−25]。选取最优超声时间为50 min。

图2 超声时间对IHP提取率的影响Fig.2 Effect of ultrasound time on the extraction rate of IHP

2.1.3 超声功率对IHP提取率的影响 由图3可知，随着超声功率的增大，IHP的提取率先增大后减小在200 W处达到最大值，300 W处有下降趋势，但是差异不显著（P<0.05），300 W之后开始降低，可能是在较大的超声功率下，超声波的振动作用、空化效应和粉碎作用过强，从而导致多糖结构受到破坏从而损失，导致多糖的提取率降低[26]。陈宇航等[27]研究超声微波协同提取豆渣水溶性多糖发现，超声功率超过300 W，多糖分子在较强的机械作用下发生断裂，从而引起提取率的急剧下降。因此选择超声功率为200 W作为最佳超声功率。

图3 超声功率对IHP提取率的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction rate of IHP

2.1.4 微波功率对IHP提取率的影响 由图4可知，随微波功率的增加，IHP的提取率增加，微波功率为100~300 W时，多糖的提取率增加显著（P<0.05），可能是由于微波功率增加，微波作用的强度增大，对细胞的细胞壁和细胞膜产生破坏作用，促进多糖的释放，从而提高多糖提取率[28]。微波功率为300~600 W时，多糖的提取率有所增加，变化不显著（P>0.05），趋于平稳，主要原因为在微波功率300 W时，原料中的多糖已经被最大限度提出来，因此多糖提取率不会继续升高，与最大值基本保持一致。最佳微波功率选取范围为200~600 W。

图4 微波功率对IHP提取率的影响Fig.4 Effect of microwave power on the extraction rate of IHP

2.1.5 微波时间对IHP提取率的影响 由图5可知，IHP的提取率随微波作用时间的增加而增加，在微波时间为50 s时，提取率达到最大值，60 s时多糖的提取率略微下降，可能是由于微波作用的时间过长，导致多糖发生热降解，导致提取率下降[29]。考虑到微波作用时间为60 s时，多糖的提取率与50 s时多糖的提取率相比，差异性不显著（P>0.05），且微波作用时间过长可能对多糖活性有影响，因此选取50 s作为最佳微波时间。

图5 微波时间对IHP提取率的影响Fig.5 Effect of microwave time on the extraction rate of IHP

2.2 响应面试验结果

2.2.1 响应面优化试验设计及结果 综合单因素实验结果，固定超声功率200 W，选取料液比、超声时间、微波时间和微波功率四个影响因素作为自变量，多糖提取率作为因变量，根据Box-Behnken的原理，使用Design Expert8.0软件进行响应面分析。实验共29个试验点，包括5个中心点。表2是响应面优化实验的设计方案及结果。

表2 Box-Behnken试验设计和结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2.2.2 二次回归模型拟合及模型分析 通过29组关于多糖提取率的响应面实验得到的二次多元回归模型为：

对该回归方程的分析见表3。由表3可知，模型的F=37.59，P<0.0001，表明该模型达到极显著水平，且失拟项P=0.1394>0.05，表明该模型拟合良好，具有统计学意义，该模型离散系数CV=1.87%，RPred2=0.8630，RAdj2=0.9482。在合理范围内，Adeq Precision=24.653，表明可以用来预测超声微波协同萃取IHP的提取率。模型中A、C、D、BD、A2、B2、D2对IHP提取率的影响极显著（P<0.01），B、BC和C2影响显著（P<0.05），而交互项AB、AC、AD和CD影响不显著，表明各因素对提取率的影响并不是简单的线性关系。从一次项来看，根据方差分析中的F值可判断各个因素对提取率的影响大小为D>A>C>B，即料液比>超声时间>微波功率>微波时间。

表3 Box-Behnken试验方差分析Table 3 Box-Behnken experiment variance analysis

2.2.3 IHP提取最优条件的确定与验证 根据所建立的二次回归模型，使用Design-Expert8.06进行参数优化分析，得到超声波微波协同提取IHP的最佳工艺条件为：超声时间51.45 min，微波时间50 s，微波功率523.89 W，料液比1:33.21 g:mL，在此条件下多糖的提取率可达85.92%。对软件得到的最佳工艺参数进行调整：超声时间51 min，微波时间50 s，微波功率500 W，料液比1:33 g:mL，在此条件下进行三次平行实验，测得IHP的提取率平均为85.61%±1.32%，与模型的预测值较为接近，表明该回归方程可以很好地反映IHP的提取率。

2.3 提取方法对IHP制备效果的比较分析

优化后的超声微波协同提取法与热水浸提法、超声辅助法对粗毛纤孔菌多糖的提取率对比，结果如图6所示。

由图6可知，三种提取方法中，超声微波辅助法提取率最高，为85.05%，其次是超声辅助法68.11%，提取率最低的是热水浸提法62.36%，超声波微波辅助提取法相对于超声波辅助法，提取率增加24.87%，相对于热水提取法，提取率增加36.38%。超声辅助法可以明显提高IHP的提取率，这主要是由于超声波的机械效应和空化效应能有效的破碎粗毛纤孔菌的细胞壁，使得多糖快速溶出，从而提高IHP的提取率[30]。超声微波辅助法提取率明显高于超声辅助提取法，可能是由于超声波和微波协同作用，对粗毛纤孔菌细胞的破碎作用增加，使多糖的溶出率提高，且超声微波协同作用可以使微波的传热均匀，弥补超声波产热不足的问题，从而提高IHP的提取率[31]。实验结果表明，超声微波辅助提取法可以明显提高IHP的提取率。

图6 不同提取方法对IHP提取率的影响Fig.6 Effect of different extraction methods on the extraction rate of IHP

2.4 提取方法对IHP体外胆酸盐结合的影响

由图7可知，三种不同方法提取的IHP对甘氨胆酸钠均有一定的结合能力，且随着质量浓度的增加，结合率也逐渐升高，呈质量浓度依赖性。但是三种方法提取的IHP在相同质量浓度的条件下对甘氨胆酸钠的结合能力存在显著差异（P<0.05），可以看出超声微波辅助提取的IHP的结合率明显高于其他两种方式提取的多糖。当质量浓度为20 mg/mL时，三种方式提取IHP对甘氨胆酸钠的结合率均达到最大值，分别是30.93%、27.32%和23.16%，其中超声微波辅助法IHP结合率最高，其次是超声辅助提取，热水浸提得到的多糖结合率最低。说明超声微波辅助法提取的IHP与甘氨胆酸钠结合能力强，推测超声微波辅助法提取的IHP降血脂效果更好。

图7 三种不同方式提取多糖结合甘氨胆酸钠能力Fig.7 Binding ability of polysaccharides extracted in three different ways to sodium glycocholate

由图8可知，三种不同方式提取的IHP均能结合牛磺胆酸钠，牛磺胆酸钠的结合率随IHP的质量浓度的增加而增加，呈一定的剂量-效应关系。从图中可以看出，超声微波辅助提取IHP对牛磺胆酸钠的结合率高于其他两种提取方式，三种方式提取多糖质量浓度为20 mg/mL时，对牛磺胆酸钠的结合率达到最高，分别是超声微波辅助提取32.13%、超声波辅助28.05%、热水浸提24.82%。

图8 三种不同方式提取多糖结合牛黄胆酸钠能力Fig.8 Binding ability of polysaccharides extracted in three different ways to sodium taurocholate

三种提取方式制备的粗毛纤孔菌多糖对两种胆酸盐的结合能力显示，超声波微波辅助提取的多糖对牛磺胆酸钠和甘氨胆酸钠的结合率均高于其余两种方式，其次是超声波辅助提取，而热水浸提的粗毛纤孔菌多糖对两种胆酸盐的结合能力最低，这可能是因为，超声波微波辅助提取法中，由于超声波和微波的作用使得粗毛纤孔菌多糖的官能团暴露出来，从而提高粗毛纤孔菌多糖对两种胆酸盐的结合量，使得粗毛纤孔菌多糖的降脂效果增加[32]。三种方式提取的IHP对牛磺胆酸钠的结合能力均强于甘氨胆酸钠，这可能是因为牛磺胆酸钠侧链末端的磺酸基的极性更大比甘氨胆酸钠侧链末端的羧基解离性更强[33]，更加易于与IHP结合。

3 结论

在单因素实验基础上，通过响应面对粗毛纤孔菌子实体多糖超声微波协同提取工艺进行优化，对软件得到的最佳工艺参数进行调整：超声时间51 min，微波时间50 s，微波功率500 W，料液比1:33 g:mL，在此条件下IHP的提取率为85.61%，与模型的预测值较为接近。与热水浸提法和超声辅助法相比，提取率分别增加了24.87%、36.83%。体外胆酸盐结合实验表明超声微波辅助提取的粗毛纤孔菌多糖对甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的结合率优于热水浸提法和超声波辅助法，呈剂量依赖性，对牛磺胆酸钠的结合率高于甘氨胆酸钠。本研究结果表明超声微波协同提取可增加IHP的提取率促进IHP的胆酸盐结合能力，为粗毛纤孔菌多糖开发成为一种降血脂功能食品提供理论依据，但其体内降脂的具体机制还需进一步研究探讨。