喙荚云实石油醚提取物对小鼠急性毒性实验研究

刘 鑫，黄 聪，潘佳艳，黄勇其

(贵州中医药大学，贵州 贵阳 550002)

豆科(Fabaceac)云实属(CaesalpiniaL.)植物全世界有100余种，中国有17种，主要分布在我国南部地区，药用种类有14种，其中3种为国家及地方药品标准收载品种，其他11种为民间用药[1-4]。黔产云实属药用植物有6种，在民族医药广为应用，如：云实(C.deapetala)为《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003版)收载品种，同时也是贵州常用的苗族药，以根或根皮入药[5]。目前，云实属药用植物的化学成份研究发现云实、苏木(C.sappan)茎中主要含有黄酮类、二萜及其内酯类、香豆素、酰胺、胡罗卜苷、β-谷甾醇、氨基酸、联苯衍生物等[6-10]。本课题前期对喙荚云实茎叶和根各极性部位进行了体外抗肿瘤活性研究，石油醚部位抗肿瘤活性最强，具有很高的成药潜力。但是一般抗肿瘤成分通常都具有毒性，如果毒性过大，则制约了抗肿瘤成分的成药性，因此本研究对黔产喙荚云实茎叶和根抗癌活性部位石油醚提取物急性毒性进行研究。

1 仪器与材料

1.1 受试药材与试剂 喙荚云实在4～5月采自贵州省册亨县，采回的药材经贵阳中医学院药学系何顺志教授准确鉴定为豆科云实属苏木喙荚云实(Caesalpiniaminax)。乙醇(EtOH)；石油醚(Pe)：AR分析纯，沸点60～90℃，批号：20121019，成都市科龙化工试剂厂。

1.2 实验动物 昆明小鼠，雌雄各半，体重18～22 g，第三军医大学实验动物中心提供，动物合格证号[SCXU(渝)2007-0005]。

1.3 实验仪器 电热恒温水浴锅：HH·S21-4北京长安科学仪器厂；数控超声波清洗器：KQ-500DE型；昆山市超声仪器有限公司JA1003 型电子天平；BüCHI旋转蒸发仪：R-215瑞士步琪有限公司；循环水真空泵：SHZ-D(Ⅲ)巩义市予华仪器责任有限公司；电子调温电热套：98-1-B 10 000 ml天津泰斯特仪器有限公司；真空干燥箱：DZ-2BCⅡ天津泰斯特仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 喙荚云实石油醚提取物的制备 将采集药材洗净后阴干，粉碎成粗粉。称取1 000 g喙荚云实粗粉(加10倍量的蒸馏水，煎煮3次每次1 h，过滤、合并滤液，减压浓缩至3 000 ml)，分成2份，各1 500 ml并转入3 000 ml分液漏斗中进行萃取，基于相似相容的萃取原理，萃取所用的试剂极性不同，本实验采用一般萃取规则由小极性到大极性依次萃取，从而可以将总提物中的各个极性部位分离出来。将已制备好的滤液转移至分液漏斗中，分液漏斗洗净后用适量真空油脂涂抹在活塞处，以防止漏液，按1∶1的比例量取石油醚进行萃取；加入石油醚萃取时充分振摇，振摇3次后静置待其分层，极性较小的一些脂溶性成分通过振摇后会充分溶于石油醚中，而水溶液及水溶液中的大极性物质因为跟石油醚不相溶而产生分层，且位于下层，故而从分液漏斗下面放出水溶液，转入烧杯中，备用；再从上面倒出石油醚萃取液，多次萃取直至石油醚萃取层至无色时合并石油醚萃取层，回收石油醚，将回收瓶中的萃取液转入蒸发皿中，挥干，之后放入真空干燥箱内真空干燥，密封袋保存于玻璃干燥器中标记备用。

1.4.2 预实验方法 预实验用昆明种18～22 g小鼠 36 只，随机分为 6 组，每组 6 只，雌雄各半。腹腔注射(ip)给药，测得 LD100=4 g/kg，LD0=1 g/kg。根据预实验结果，初步摸索出小鼠的死亡剂量，根据预试验结果，正式实验注射药物浓度，分为4组，各组剂量间比值为 0. 7 分别为4.00 g/kg、2.80 g/kg、1.96 g/kg、1.37 g/kg，生理盐水稀释。

1.4.3 喙荚云实石油醚提取物半数致死量(LD50)的测定 采用改进寇氏法。腹腔注射(ip)给药。由4 g/kg开始按1∶0.7比例等比稀释得一系列的浓度供试液。取小白鼠40只，雌雄各半，随机分为4组，每组10只，各组分别以不同浓度供试液按20 ml/kg给药容量一次性ip给药，观察14 d，逐日记录各组小鼠死亡数和中毒反应。计算得喙荚云实石油醚提取物ip给药LD50和95%可信限。

2 结果

2.1 小鼠中毒症状观察 对照组小鼠生长及行为正常，体重增加。4组小鼠，大多状态良好，行为活动正常，部分出现活动减少，四肢颤动，小便失禁，呼吸困难，翻正反射消失，随后死亡。1、2、3 组则大多停止进食及饮水，一部分小鼠活动量明显减少、身体蜷缩并不断抖动、全身震颤等症状；一部分小鼠给药后在笼内上蹿下跳，烦躁不安，啃咬鼠笼、精神亢奋、活动增加。

2.2 喙荚云实石油醚提取物毒性实验结果 统计给药后14 d内各组动物死亡数，使用Bliss法计算喙荚云实石油醚提取物半数致死量。计算出喙荚云实石油醚提取物半数致死量LD50=1.961 g/kg；Feiller 法校正LD5095% 的可信限=1.650～2.330 g/kg；LD5=1.650 mg/kg，LD95=2.330 mg/kg。见表1。

表1 喙荚云实石油醚各组小白鼠用药、死亡情况及计算(n=10，K=0.7)

2.3 小鼠各器官脏器重量 解剖各组小鼠，取脏器称重。结果见表2。

表2 喙荚云实石油醚各组小白鼠脏器重量影响(n=10)

3 讨论

贵州省拥有丰富的云实属性植物资源，黔产云实属药用植物有 6 种，喙荚云实为其中之一，该植物资源丰富，其种子在民间用药广泛且疗效显著[5]。喙荚云实传统用药部位为种子，其具有良好的抗肿瘤作用，为探索喙荚云实的茎叶和根是否具有抗肿瘤作用，来扩大药用资源范围。本课题组对云实属植物具有较扎实的研究基础，已完成的国家自然科学基金项目(39560088)“从国产云实属植物中筛选替代进口塔拉资源的研究”取得一定的研究成果。本课题组前期实验结果表明，茎叶和根的石油醚部位有明显的抑制肿瘤作用为其活性最强部位，其开发成抗肿瘤药物的潜力较大。但通常抗肿瘤成分也有一定的毒性，因此在本研究中对喙荚云实茎叶和根石油醚提取物的急性毒性进行研究。

在前期实验中发现喙荚云实石油醚提取物的口服生物利用度很低，腹腔注射给药效果很好，因此在本研究中采用腹腔注射给药。在实验中最低剂量组的动物行为大部分正常，而在其他组别中均出现活动减少、抖动、精神亢奋等异常状态。在小鼠解剖时发现，肝脏明显肿大、淤血，其他脏器未见异常，由此可推测喙荚云实石油醚提取物的主要毒性在肝脏。半数致死量为LD50=301.75 mg/kg，LD5095% 的可信限=1.650～2.330 g/kg。本研究的结果对云实属植物资源的合理利用和抗癌新药的开发研究具有深远的意义。