广州管圆线虫现代检验技术研究进展

王乾宇

(黔南民族医学高等专科学校，贵州 都匀 558013)

广州管圆线虫(Angiostrongylus cantonensis)是主要分布在亚太地区的一种蠕虫类寄生虫，最早由我国学者陈心陶教授在上世纪30年代发现并命名为广州肺线虫(Pulmonema cantonensis)[1]，后几经周折，于1946年更名广州管圆线虫[2]。在分类上，广州管圆线虫属于后圆线虫超家族、管圆线虫家族，其终末宿主为啮齿类尤其是家鼠和褐家鼠，中间宿主为软体类动物如福寿螺、褐云玛瑙螺、蜗牛和蛞蝓等，而淡水鱼(虾、蟹)、蛙、蛇等为转续宿主，人类是其非适宜宿主。一般认为广州管圆线虫是人体嗜酸粒细胞增多性脑脊膜炎或脑膜脑炎(EM或EME)的重要病原体。人类通过生食或半生食以上螺类、醉虾、醉蟹、蛙类、蛇胆、蛇肉或被具有传染性的Ⅲ期幼虫污染的蔬菜等食物后被感染。一旦感染广州管圆线虫其可在人体器官中移行、发育成Ⅳ期、Ⅴ期幼虫并寄生在人体不同部位，蠕虫在大脑中移动带来的损伤以及人体对死亡虫体的强烈免疫反应引发嗜酸性粒细胞增高性脑膜炎、脑膜脑炎、嗜酸性粒细胞性脊神经根脑膜炎、脑脊神经根炎等病症，有的甚至在眼部发现其成虫。因侵袭部位不同，患者会出现多种症状而造成诊断困难：轻微的感染可能导致头痛、颈部和肩部疼痛、皮肤敏感和刺痛、视觉障碍、各种其他症状，有时还有一些发烧，所有这些症状都可能自动消失，甚至患者自身都未意识到他们已经被感染。但是感染严重时这些症状可能更加严重，并可能出现其他的症状，如运动障碍和消化和尿路功能障碍，甚至昏迷或死亡[3]。

在温暖的地区或季节，容易爆发广州管圆线虫疫情，近二、三十年以来，在我国广东、广西、云南、湖南、福建等地都有疫情记录[4]。近期的监测数据显示，在广动江门螺类总阳性率为5.78%，福寿螺阳性率达13.89%[5]。贵州南部、东南部地区居民有食凉拌螺、生鱼、腌渍鱼的传统，而福寿螺等惊人的繁殖能力使其虫卵在田埂上随处可见，在贵州市售的食用螺中检出广州管圆线虫感染率：福寿螺为0.4%；褐云玛瑙螺感染率为11.3%[6]，加之稻田鱼养殖等方兴未艾，诸多因素使得本地居民爆发感染广州管圆线虫的风险日益增加。为保护人民健康，国家对广州管圆线虫病高度重视并投入科技力量研究该病的防治。

病原虫的检出是人类广州管圆线虫检测的金标准，但因虫体数量少、密度低以及移行等原因，广州管圆线虫检出率在患者脑脊液、眼等部位检出率极低，目前仅为2%～12%[7]，传统的粪检等也无法检出，不能满足临床病原学诊断需要。免疫学检测是常用的方法[8]，主要有：(1)间接荧光抗体试验(IFAT)，用成虫或Ⅲ期幼虫制作冷冻切片作为抗原，可以检出大鼠或人抗血清中的抗体；(2)免疫酶染色试验(IEST)，此法结合了免疫反应的高特异性和酶促反应的高效性，简便易行，判断结果时无需特殊仪器设备，适合现场应用，可考虑作为辅助诊断方法；(3)酶联免疫吸附试验(ELISA)，因对血清具有较高的敏感性和特异性得到较广地应用，虽对旋毛虫抗体阳性血清、犬弓蛔虫抗体阳性血清时分别有20%和10%的假阳性，但对特定人群，如疫区人群进行流行病学调查时，ELISA仍不失为一类有效的检测方法[8]。要注意的是以上这些免疫学检测方法涉及的抗原抗原种粗抗原、纯化抗原等等，而抗原的提纯也是方法各异、标准各异，没有统一的标准。另外临床上有少数病例未出现发热、嗜酸性粒细胞增多等典型指征，容易被误诊[9-10]。综上，研发特异、灵敏、简便的检测方法具有重要意义。以下主要综述了近10年来广州管圆线虫检测方法的研究进展。

1 PCR及衍生技术

1.1 常用PCR技术 PCR技术是近年来飞速发展的分子生物学检测技术，欧阳颐[11]对2017年以前的广州管圆线虫分子生物学研究进行了阶段性回顾：用于检测的PCR方法主要有PCR、反转录PCR(RT-PCR)和实时荧光定量 PCR(qRT-PCR)等，主要扩增遗传标记为核糖体DNA内转录间隔2区(ITS2)、小亚基核糖体 RNA(SSU rRNA)、细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)及核糖体18S rRNA基因等。18S rRNA基因保守度较高，来自世界各地的样本相似度高达99%，但对以上目的基因或基因片段的遗传距离分析显示来自全球不同地区的原虫分离株具有遗传多态性，可以作为分子水平的检测方法，但是世界各地的PCR检测方法不一，可比性不强，最好有统一的PCR控制程序及质量控制标准[12]。另外PCR检测需要特定的仪器、耗时较长，对于野外监测有难度。

1.2 环介导等温扩增技术(LAMP) 与传统PCR方法相比，环介导等温扩增技术(LAMP)具有实验条件简单、易操作、筛选更精细的特点：DNA扩增在等温水浴加热时即可进行、不需要可变温的PCR程序和特殊仪器、结果直接在反应管中即可观察，一些改进的LAMP对于单核苷多态性(SNP)或基因突变都有很好的检出能力，应用于多个领域，也更适合野外监测。LAMP开始应用于检测螺内感染广州管圆线虫，且检出率远高于形态学检测法。LAMP方法使用的酶是Bst DNA聚合酶，在等温条件下用它合成一条新的DNA链，同时置换互补链从而形成茎环结构，扩增茎环可积累肉眼可见的产物。LAMP反应需要四种引物：FIP、BIP、F3和B3。F3和B3有助于形成茎环结构，FIP、BIP与茎环内结构互补用于放大目标序列[13]。但这个方法需设计多对引物，假阳性问题难以避免[14]。

1.3 重组酶介导的等温扩增技术(RAA) 重组酶介导的等温扩增技术(RAA)属于等温扩增技术的一种，是近年来快速发展的病原体鉴定分子工具，可在恒温条件下实现核酸扩增、短时间内完成检测，比之常用的PCR法、LAMP法，该方法具有操作方便快速、引物设计简单、经济合算的优势，已有多个成功应用于寄生虫检测的案例报道[15-16]。张强等[17]用生物信息软件筛选出广州管圆线虫内转录间隔区1(ITS1)最保守的一段序列(长度为174 bp)作为目标检测序列，设计、合成出特异性最强的上下、游引物和探针，构建了反应体积为50 μl的荧光RAA反应体系，可在37 ℃、5～10 min内完成扩增反应，检测灵敏度可达100 pg/μl，而常见的寄生虫如曼氏血吸虫成虫、似蚓蛔线虫虫卵、华支睾吸虫成虫、以及藁杆双脐螺、小管福寿螺螺体组织基因组均呈阴性，说明该法的特异性较好，是较好的监测方法。

2 免疫学检验方法

在以往的免疫学检验方法中，抗原的获取具有一定的经验性和盲目性，另外需要考虑主要的治病阶段以及虫体的不同性别。随着组学技术、分子生物学技术的发展，一些酶或肽段的发现，使免疫学检验方法的目的性和精准性大大提高。

用蛋白质组学技术筛选出特异性和灵敏度高的通用抗原，对于原虫的检测、免疫诊断和免疫调节都具有重要意义。凝集素(lectins)是具有特异性糖识别位点的可溶性糖蛋白，可以通过多种途径影响生物体的免疫过程，因此针对动物体内的半乳糖凝集素等也开发出特异性较好的免疫学检测法。黄慧聪等[18]利用蛋白质组学技术：双向电泳联合免疫印迹技术分离得到具有免疫原性的可溶性蛋白质，利用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF-MS)鉴定得出两个广州管圆线虫V期雌雄幼虫的共同抗原-半乳糖凝集素和肌动蛋白，利用生物信息学进一步进行肽段抗原表位预测及免疫印迹验证，鉴定半乳糖凝集素具抗原功能的肽段序列为P16(192-207)KNGDIALHFNPRFDEK。此结果为广州管圆线虫的的诊治和免疫学研究提供一个新的切入点。李星潘等[19]用RT-PCR的方法克隆到Ac-gal 1基因并在原核细胞中成功表达出可溶性活性蛋白，此galectin-1蛋白能被全虫免疫的小鼠血清识别并与小鼠红细胞发生凝集反应。

虾红素金属蛋白酶(ALMP)在寄生虫寄生生活中发挥一系列生物学功能，余良等[20]用RACE技术调取到基因并进行了体外原核表达，用 real-time PCR、免疫荧光定位法研究了其在各时期、各部位的表达情况，推测ALMP与感染期幼虫对宿主的入侵和组织渗透、蜕皮、摄食和消化以及雄虫的生殖密切相关。

这些研究为进一步探索广州管圆线虫的生活史、防治、疫苗开发奠定了坚实基础。

3 高通量测序技术

随着测序技术不断成熟、成本不断下降，高通量测序技术被广泛用于疾病筛查、诊断。婴幼儿感染广州管圆线虫后临床症状多不典型，仅依靠临床表现和临床常规检查往往易贻误诊治造成严重后果。陈鸿等[21]报道了2例成功用高通量测序诊断广州管圆线虫嗜酸性脑膜脑炎(AEM)的案例，提示临床上对疑诊细菌性脑膜炎而治疗效果欠佳患儿应考虑广州管圆线虫感染可能，结合血与脑脊液中的嗜酸粒细胞指标，及时抽取脑脊液进行病原学高通量基因测序，可尽早明确诊断，调整治疗，改善预后。表明高通量测序对于AEM诊断具有临床价值，也切实可行。

4 纳米金标记技术

纳米金是指粒径为1～100 nm的金粒子,由于粒径的减小使得纳米粒子获得很多界于宏观与微观范围内特性，比如与粒径大小相关光吸收及散射性能、比表面积大活性高、强抗氧化性、表面等离子共振性等，这些特性均可用于开发特异性、灵敏性较好的检测方法。纳米金技术已经在不少病原生物检测中得到应用。纳米棒(AuNRs)因具有强大的电场强度、吸附性能、光吸收与散射、双向等离子吸收等性质在众多金纳米颗粒脱颖而出[22]。孔玉方[23]成功制备广州管圆线虫幼虫粗抗原、成虫粗抗原、排泄分泌粗抗原等多种抗原功能化纳米金棒，并考察了不同感染时间、不同感染度及不同浓度的血清抗体的结合情况，根据表面等离子共振吸收峰红峰移位值筛选出最适条件并与传统ELISA法进行了比较，认为广州管圆线虫粗抗原功能化纳米金棒具有制备简单、成本低、敏感性和特异性较好的优势，为开发用于感染早期、低感染度的广州管圆线虫病调查和检测奠定了良好基础。

近年来，广州管圆线虫的检测方法随着分子生物学、免疫学、PCR衍生技术、纳米金生物标记技术以及高通量测序技术的发展与普及得到发展和丰富，在病原虫的早期筛查、环境监测、生活史、致病机制研究等方面取得了大的进步，为疾病的尽早、尽快、准确检测、诊断、治疗奠定了良好基础。因为广州管圆线虫病为食物摄入引起，建议在肠道微生态菌群改变及免疫应答适应等方面展开研究，为实现更早的发现、诊治疾病拓展思路。