农杆菌介导的栓皮栎体胚遗传转化初步研究

罗珍珍 张存旭 朱景乐 王 敏 张艳婷

（1. 西北农林科技大学林学院，陕西 杨凌 712100；2. 国家林业和草原局泡桐研究开发中心，河南 郑州 450003）

栓皮栎（Quercus variabilis）属于壳斗科（Fagaceae）栎属，是我国特有的落叶乔木，广泛分布于华北、华南、西南地区。除了能进行木材、薪材、食用菌、天麻、橡子、栲胶生产外，树皮木栓层剥取后还可制软木，是我国最主要的软木资源树种，具有重要的生态价值和经济价值[1]。近年来，由于栓皮栎林受到环境影响、人为破坏以及病虫危害导致生产力下降。林木遗传改良是提高生产力和抗病虫害能力的重要途径，然而栓皮栎种子繁殖周期长，常规无性繁殖生根困难，这已成为该树种遗传改良的限制因子。

随着现代生物技术的发展，人们已将植物基因工程和常规育种相结合，以便加快遗传改良的进程。其中，农杆菌介导的遗传转化是植物转基因强有力的生物技术工具。以植物器官发生作为转化受体系统，国内外已先后在蓝桉（Eucalyptus globulus）[2]、杨树（Populus alba×P. berolinensis和Populus davidiana×P. bolleana）[3]、马尾松（Pinus massoniana）[4]等树种上得到转化植株。用体胚发生作为转化受体系统在辐射松（Pinus radiate）[5]、扁柏（Chamaecyparis obtusa）[6]、核桃（Juglans hindsii‘Rawlins’×Juglans regia）[7]等树种实现了遗传转化。

GUS基因（β-glucuronidase）和hptII基因（hygromycin phosphotransferase II gene）是遗传转化中常用到的报告基因和标记基因。GUS基因编码β-葡糖醛酸酶，β-葡糖醛酸酶作用于X-Gluc的产物经过氧化形成不溶解的蓝色物质，使具有GUS活性的部位呈现蓝色，常依据此原理检测目的基因的转入[8]。hptII基因编码潮霉素磷酸转移酶，转移到植物细胞后可赋予对潮霉素的抗性，用于抗性组织的筛选[9]。

在栎类树种中，Vidal等以Quercus robur的叶片诱导的体胚作为农杆菌介导的转化受体，成功实现植株再生[10]。Álvarez等建立了成龄欧洲栓皮栎（Quercus suber）的遗传转化系统，获得了43%的转化率[11]。而栓皮栎的遗传转化研究较少。本研究以栓皮栎体细胞胚胎发生为受体系统，研究影响农杆菌介导遗传转化的关键因素，为利用基因工程对栓皮栎进行遗传改良建立一个可靠、可重复的遗传转化体系。

1 材料与方法

1.1 植物材料

选取西北农林科技大学北校区的单株栓皮栎，采集授粉后7～8周的坚果，剥取未成熟合子胚，在添加了0.4 mg/L 6-BA和0.4 mg/L 2,4-D的MS培养基上诱导体胚发生，以其中一个胚性细胞系用于遗传转化研究。胚性组织通过次生体胚发生的方式在增殖培养基上保持与增殖，每4周继代1次。

1.2 培养基与培养条件

所有培养基以MS为基本培养基[12]，均添加3%蔗糖和0.6%琼脂。其中，增殖培养基添加0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D；预培养基添加1.0mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L水 解 酪蛋白+400 mg/L谷氨酰胺；共培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L水 解 酪 蛋 白+400 mg/L谷氨酰胺+乙酰丁香酮（AS）；选择培养基添加1.0 mg/L 6-BA+0.25 mg/L NAA+200 mg/L水解酪蛋白+400 mg/L谷氨酰胺+30 mg/L潮霉素（Hyg）+300 mg/L头孢霉素（Cef）。pH值调到5.8后在121 ℃高压灭菌30 min。培养条件为(25±2) ℃，暗培养。

1.3 遗传转化

1.3.1 菌株与载体

农杆菌菌株为EHA105，转化载体为pCAMBIA1301，该质粒载体携带有潮霉素抗性基因hptⅡ和GUS报告基因[8]。菌株与载体由西北农林科技大学彭少兵教授提供。

1.3.2 农杆菌的活化

挑取农杆菌EHA105单菌落，接种于含有50 mg/L卡那霉素、20 mg/L利福平的LB液体培养基中，在28 ℃条件下200 r/min摇菌24 h。之后于3 000 r/min离心沉淀，再将沉淀重悬于MS基本培养基中至所需的OD600备用。

1.3.3 抗生素敏感性试验

将胚性组织分别接种到含有不同浓度潮霉素、头孢霉素的预培养基上。潮霉素浓度设定为4、15、30、50 mg/L，头孢霉素浓度设定为100、150、200、250、300 mg/L。

1.3.4 转化试验

分离2～3个球形或心形/鱼雷期的体胚小团块，在预培养基上培养5、10、15 d，置于OD600=0.25、0.5、0.8的菌液中侵染10、20、30 min，取出并用无菌滤纸吸去表面多余的菌液，后接入共培养基（添加50、100、200 μmol/L乙酰丁香酮）中培养1、3、5 d，再转接到选择培养基培养。进行其中的某个因素试验时，其他因素设定为：不经过预培养，OD600=0.5，侵染时间为20 min，共培养天数为3 d，AS浓度为100 μmol/L。此后，新生的次生胚在选择培养基上每2周继代1次进行胚性组织的增殖培养。

1.3.5 GUS组织化学染色

将经过4周选择培养后产生的次生胚团块浸入改良的Jefferson GUS反应缓冲液[13]，缓冲液组成为50 mmol/L Na2HPO4+NaH2PO4，pH值 7.0；2 mmol/L K3[Fe(CN)6]；2 mmol/L K4[Fe(CN)6·3H2O]；10 mmol/L Na2EDTA，pH值 8.0；0.1%Triton X-100；2 mmol/L X-Gluc。在37 ℃保温24 h后，用体视显微镜（OLYMPUS SZX16）观察。

1.3.6DNA的提取和GUS基因的PCR检测

采用植物基因组DNA提取试剂盒（康为世纪CW0553S），从胚性组织中提取DNA作为模板。GUS基因的上游引物为5′-TACCGACGA AAACGGCAAGA-3′，下游引物为5′-GCTAAC GTATCCACGCCGTA-3′。扩增体系组成：2 μL模板，1 μL上游引物，1 μL下游引物，10 μL 2×TaqPCR Pre Mix，6 μL dd H2O。扩增条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s；62 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s；72 ℃延伸5 min；4 ℃终止；4 ℃保存，30个循环。每个PCR产物（1 μL）与1 μL上样液染料混合上样，采用1×TAE缓冲液制成的2%琼脂糖凝胶电泳分离，核酸染料染色，用凝胶成像仪（君意电泳JY04S-3E）检测PCR产物扩增。

1.4 数据采集和统计分析

试验均为单因素试验，设计每一处理20个外植体为1次重复，共重复3次。培养4周后统计体胚成活率和GUS转化率。成活率为成活的体胚团块数量占每个处理接种团块总数的百分比，GUS转化率为GUS染色呈蓝色的体胚团块数量占每个处理成活团块数的百分比。数据表示为平均值±标准误。采用SPSS 20.0软件对数据进行统计处理，其中包括方差分析和最小显著差数（LSD）测验。

2 结果与分析

2.1 抗生素对胚性愈伤组织成活的影响

潮霉素对胚性组织成活的影响如图1所示，当培养基中潮霉素的浓度为4 mg/L时，对胚性组织几乎没有影响，成活率为98.3%，与0 mg/L浓度下的成活率相比并没有显著差异；当培养基中潮霉素浓度为15 mg/L时，成活率下降为53.3%，与0 mg/L浓度下的成活率有显著差异；浓度达到30 mg/L时，组织体积变小，与培养基相接触一侧的组织很快褐化，长势逐渐变差，并且没有再长出次生胚，1个月后这些组织完全变黑，最终死亡，30 mg/L潮霉素导致组织成活率非常低，仅为1.7%；当潮霉素浓度为50 mg/L时，胚性组织全部变黑死亡，无次生胚产生。30 mg/L和50 mg/L浓度下的成活率与其他浓度下的成活率有显著差异，但这二者之间没有显著差异，综合考虑，把30 mg/L 潮霉素作为栓皮栎胚性组织的筛选压。

图1 潮霉素对胚性组织的影响Fig. 1 Effect of hygromycin on embryogenesis cluster

胚性组织在含不同浓度头孢霉素的培养基中培养4周后，成活率各有不同。图2可以看出，添加100 mg/L的头孢霉素对胚性组织成活率的影响并不明显；当头孢霉素浓度达到150 mg/L时，胚性组织长势变差，成活率为63.3%，与100 mg/L浓度下的成活率相比有显著差异，而与200 mg/L浓度下的成活率相比并没有显著差异；另外在250 mg/L的情况下，大部分组织逐渐发黑、褐化，33.3%的组织仍存活并有次生胚产生；当培养基中添加的头孢霉素浓度为300 mg/L时，胚性组织绝大多数变黑死亡，仅有5%成活，与其他浓度下的成活率相比均有显著差异。因此，可将300 mg/L头孢霉素也作为栓皮栎胚性组织的筛选压。

图2 头孢霉素对胚性组织的影响Fig. 2 Effect of cefotaxime on embryogenesis cluster

2.2 预培养时间对遗传转化的影响

由表1可以看出，适当时间的预培养可提高体胚成活率与GUS转化率。随着预培养时间的延长，成活率逐渐升高，预培养15 d的成活率最高。对于GUS转化率，预培养15 d的转化率最高，达到91.7%，与预培养5 d和10 d的效果相比差异显著，因此15 d为适宜的预培养时间。

表1 预培养天数对遗传转化的影响Table 1 Effect of pre-cultivation days on genetic transformation

2.3 菌液浓度和侵染时间对遗传转化的影响

随着菌液浓度的升高，体胚成活率与GUS转化率均呈现先升高后降低的趋势。由表2可知，菌液浓度OD600为0.25时，GUS转化率较低；OD600=0.5时，体胚成活率升高，GUS转化率达到100%；OD600为0.8时由于农杆菌污染严重难以脱菌，造成体胚成活率极低，仅为1.7%，而后导致转化率为0。综合考虑，侵染栓皮栎体胚的适宜农杆菌菌液浓度OD600为0.5。

表2 菌液浓度对遗传转化的影响Table 2 Effect of Agrobacterium concentration on genetic transformation

侵染时间延长，体胚成活率与GUS转化率先升高后降低。由表3可知，农杆菌侵染体胚时，侵染10 min农杆菌不能有效地在伤口处吸附，共培养后农杆菌生长较少，在后续培养中体胚的转化率低；侵染20 min时，体胚成活率与GUS转化率最高，分别达到11.7%和82.9%；当侵染30 min时，农杆菌对体胚的毒害作用较大，造成体胚成活率与转化率低。各侵染时间的GUS转化率无显著差异，考虑到侵染20 min时的体胚成活率最高，因此将20 min作为适宜的侵染时间。

表3 侵染时间对遗传转化的影响Table 3 Effect of infection time on genetic transformation

2.4 共培养时间和乙酰丁香酮对遗传转化的影响

侵染之后进入共培养阶段。由表4可知，体胚与农杆菌共培养1 d的成活率和转化率最低。共培养时间为3 d时，成活率最高，转化率达到100%；共培养5 d时，由于受体材料与农杆菌共培养时间过长，农杆菌过度生长而对体胚产生毒害，造成后续培养脱菌困难，成活率和转化率都有所降低。虽然各个共培养时间的GUS转化率无显著差异，考虑到共培养3 d的成活率与转化率最高，因此适宜的共培养时间为3 d。

表4 共培养时间对遗传转化的影响Table 4 Effect of co-cultivation time on genetic transformation

乙酰丁香酮对Vir区基因的活化具有重要作用，在共培养基中加入适量乙酰丁香酮有利于转化。表5可知，当乙酰丁香酮浓度为50 μmol/L时的成活率和GUS转化率最低，随着乙酰丁香酮浓度的升高，体胚成活率与GUS转化率也逐渐升高，200 μmol/L时的成活率和GUS转化率最高，分别为15.0%和100.0%。因此，在共培养基中添加200 μmol/L的乙酰丁香酮最为适宜。

表5 共培养基中添加乙酰丁香酮浓度对遗传转化的影响Table 5 Effect of concentration of AS added to co-culture medium on genetic transformation

2.5 GUS染色和PCR检测

GUS组织活性检测结果表明，经过GUS组织化学染色，转化的胚性组织呈蓝色（图3d）。本研究中，使用GUS基因表达的结果确定转化条件，最终得到了转GUS基因组织，目前，导入GUS基因的胚性组织正在进行体胚成熟培养，然后再进行植株再生培养。在经过GUS染色验证的转化胚性组织中选取12块组织作GUS基因检测，同时，以未转化组织为阴性对照，质粒DNA为阳性对照。阳性质粒对照和1、2、3、5、6、7、8、10、11、12号转化胚性组织均能扩增出1 086 bp的目标条带，进一步证明GUS基因已转入到体胚中。而未转化对照组织和4、9号组织不能扩增出目标条带（图4），初步确定4和9为假阳性组织，其他为阳性组织。

图3 遗传转化外植体及瞬时GUS表达Fig. 3 Explants used for genetic transformation and transient GUS expression in somatic embryos

图4 转化体胚的PCR分析Fig. 4 PCR analysis of transformed embryos

3 结论与讨论

农杆菌介导遗传转化过程中一般经预培养、共培养、抗性筛选培养、转基因再生等多个环节[14]。共培养结束后，需要用抗生素抑制农杆菌的生长，并利用抗性筛选转化细胞，根据所用质粒的不同，选用的抗生素也不同。在前人的研究中多采用卡那霉素和潮霉素作为选择抗生素，头孢霉素作为抑菌抗生素[15-16]，而不同植物对各种抗生素的耐受力也各不相同。在Sánchez等[17]测试的所有卡那霉素浓度下，组织块均可以存活，表明卡那霉素不足以作为筛选转化组织的抗生素，而潮霉素和头孢霉素的浓度分别为50 mg/L和300 mg/L是选择抗生素的适宜剂量。本研究中，在选择培养阶段潮霉素和头孢霉素的适宜浓度分别为30 mg/L和300 mg/L，由于树种的不同导致所用潮霉素剂量不同。

一般而言，植物材料先经过一段时间的预培养后再进行浸染，既可以减少农杆菌的损伤又能促进细胞处于最佳分裂状态，提高转入基因的表达和稳定整合率，但不同植物对农杆菌的敏感度不同[18]，本研究发现经过15 d预培养的栓皮栎体胚转化率最高，而张晓英等[19]将国槐（Styphnolobium japonicum）叶片预培养5 d达到最佳效果。菌液浓度过高、侵染时间过长，农杆菌会对组织产生较大伤害，菌液浓度过低、侵染时间过短，则减少了T-DNA的整合概率而使转化率降低[20]；本研究发现菌液浓度为OD600=0.5侵染20 min时，转化率最高，此结果与Álvarez等[11]的结果基本一致。

农杆菌附着在组织上不能立即转化，只有经过适当的共培养才能完成基因向植物细胞转移，从而整合到植物基因组。本研究将携带农杆菌的胚性组织共培养3 d转化率可达到100%，但是组织的染色呈现出局部蓝色或蓝色较浅，在所用的共培养基中加入200 μmol/L乙酰丁香酮后得到的组织染出了整体均匀的深蓝色，达到GUS表达的最佳效果，王蓓蓓等[21]也发现共培养3 d、添加200 μmol/L乙酰丁香酮对杂种白杨353（Populus tremula×Populus tremu-loides）的叶盘分化率有提高；而贾小明等[16]却发现共培养基中添加AS对河北杨（Populus hopeiensis）叶片转化率没有明显影响，分析其原因，AS的效果可能与菌株类型、植物种类和共培养基的pH值有关，AS与其他因素的交互作用还有待进一步研究。乙酰丁香酮作为一种诱导性较好的酚类化合物，主要是用来诱导农杆菌Vir区基因的活化与表达，促进T-DNA的加工和转移[22]。目前，在大多数的研究中，无论是侵染液还是共培养基，乙酰丁香酮的有效使用浓度一般在50～200 μmol/L。

GUS是被广泛使用的报告基因系统之一。杜丽等[14]通过对胚性愈伤组织GUS染色呈现出的蓝色确定了GUS基因的导入。林义章等[23]根据GUS基因设计引物对再生植株进行PCR检测，证实GUS基因已成功转入到植株基因组中。本研究通过GUS染色和PCR检测，证实了GUS基因的转入。

总之，本研究分析了影响农杆菌介导的栓皮栎遗传转化的不同因素。其中，预培养时间、菌液浓度和乙酰丁香酮浓度这3个因素是影响转化率的关键。通过本试验得到了栓皮栎的阳性体胚，将进一步进行植株再生。初步建立了以栓皮栎体胚发生为受体的遗传转化系统，为进一步建立高效、稳定的遗传转化体系奠定了基础。