干旱后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响

张玉玉 王进鑫 马 戌 吕国利 冯树林

（1. 西北农林科技大学水土保持研究所，陕西 杨凌 712100；2. 西北农林科技大学资源环境学院，陕西 杨凌 712100；3. 农业部西北植物营养与农业环境重点实验室，陕西 杨陵 712100）

叶绿素是植物类囊体膜上色素蛋白复合体的重要组成部分，是绿色植物进行光合作用的基础物质和关键构成因子。叶绿素含量的高低可反映光合能力的强弱，叶绿素含量越低，光合作用越弱，不利于植物的生长[1]。也可反映植物抗逆性的强弱，大量研究表明干旱胁迫使得植物叶绿素含量降低[2-3]，也有研究表明植物叶绿素含量经干旱胁迫后会出现升高的趋势，或者变化不显著[4-6]。初江涛等[7]研究发现，随着土壤含水量的减少，侧柏（Platycladus orientalis）叶绿素含量呈现先降后升的趋势。马仁义等[8]研究表明，侧柏比祁连圆柏（Sabina przewalskii）对干旱胁迫更为敏感，受持续干旱的影响更大。刘俊峰等[9]研究发现，侧柏幼苗叶绿素含量随胁迫程度的加剧而降低，其重度水分胁迫处理与对照差异显著。干旱是影响植物生长和生理生化的主要非生物胁迫[10]。由于自然界的降雨脉冲及人为灌溉等原因，不仅在干旱半干旱地区经常会出现土壤缺水和干湿交替的现象，而且在南方等非干旱地区也经常出现季节性干旱。当植物处于干旱环境时，会通过调动自身的生理生化过程或启动自我的保护机制来避免自身受到损伤[11-12]。植物在生长发育过程中，均呈现出一定的阶段性变化规律，且在不同生长阶段对环境的要求也存在着明显的异质性[13-14]。徐国伟等[15]通过对水稻（Oryza sativa）的研究，发现水稻在不同的生育时期叶绿素的含量明显不同，随着生长发育的进程，水稻叶片叶绿素含量先增加后降低，成熟期最低。王进鑫等[16]研究发现，对侧柏幼树蒸腾耗水影响较大的是生长盛期的土壤供水状况，生长后期次之，生长前期影响最小。因此，侧柏幼苗在生长盛期对土壤水分的响应更加明显。目前有关侧柏叶绿素含量的研究，多以干旱胁迫及旱后复水的短时效应较为常见[17-18]，而前期干旱对侧柏叶绿素含量在后期复水过程中恢复能力的长期影响的研究几乎没有。吴训[19]研究发现，植物的生长对水分胁迫存在滞后现象，复水后植物生理机能的修复过程存在滞后效应。复水效应包括激发效应和补偿效应，其中复水补偿效应是指植物在受到的水分胁迫在阈值以内，又具有恢复因子和时间的条件下，在其生理等方面产生的有利于植物生长发育的能力[20]。Zhang等[21]研究发现，不同植物对不同程度水分胁迫的响应和复水补偿效应具有不同的调亏机制和补偿能力。因此，研究生长盛期侧柏幼苗叶绿素含量经过干旱胁迫后复水的变化，分析干旱胁迫及旱后复水对叶绿素含量的影响，了解侧柏幼苗叶绿素含量对干旱胁迫及旱后复水作出的响应，进一步反映侧柏幼苗光合作用的变化，为侧柏在土壤干湿交替变化的条件下更好的生长提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验地点和材料

试验在陕西杨凌西北农林科技大学南校区（108°7′E，34°16′N）防雨旱棚内进行，该地区属于暖温带半湿润大陆性季风气候，降水季节分配不均匀，年均降雨量635 mm，有78%的雨量集中在5—9月。年平均相对湿度为70%，年平均气温为12.9 ℃，1月平均气温为-1.2 ℃，7月平均气温为 26.0 ℃，≥10 ℃年有效积温 4 169.2 ℃，年干燥度1.1。

试验选取地径、株高和根系基本一致的1年生侧柏幼苗，冲洗根系后用吸水纸吸干苗木表面水分，于2019年3月15日栽植在口径29 cm、深27 cm的塑料桶中，每桶栽植2株，并对其进行编号。栽培基质为塿土，质地粘壤，通透性良好，田间持水量为22.3%，充分风干后过筛，除去石砾、结核及林草根系，充分混匀后每盆装10 kg。采用边埋边压边提苗的方式栽植，并在土层表面铺盖2 kg石砾以减少土体表面蒸发。浇灌一定体积的水，以保证苗木成活。然后放置室外自然透风塑料旱棚内，使侧柏盆栽土壤水分维持在80%～90%最大田间持水量。

1.2 试验设计

本试验参照王进鑫等[16]、吉增宝等[22]的研究，设置干旱胁迫持续时间（15、30、45、60 d ）和土壤水分梯度（土壤相对含水量（RSWC）为40%、52.16%、70%、87.84%）2个因素来布设试验，每个处理4个重复。以RSWC为100%，充分供水为CK，共17个处理。干旱胁迫外的所有时间内按照100%相对含水量对各处理供水。采用称重法对侧柏盆栽进行控水处理，每天18：00称量，并补充当日失去的水分，以保证各处理维持在试验设定的土壤含水量，持续时间为60 d。试验期间栽培基质保持自然肥力，不施肥。整个试验过程中，以大棚内自然温度和光照为主，采用人为适时控制补水的办法，使土壤水分达到试验要求。为了减少环境因素对试验结果的影响，将各处理干旱胁迫的结束时间调整到同一天（8月15日）。

2019年6月10日对控水60 d的侧柏幼苗盆栽进行水分控制，将表面的石砾去掉，增大土壤表面蒸发或适当补水，使其在6月15日相应的土壤含水量达到40%、52.16%、70%、87.84%，以此类推，分别在6月25日、7月10日、7月25日对控水45、30、15 d的处理进行上述操作，CK土壤相对含水量保持100%。于8月15日上午8：00开始取侧柏幼苗不同方位当年生成熟健康的鳞叶置冰袋并迅速带回实验室。下午6：00对各处理进行复水（按土壤相对含水量100%复水），并于复水后1、3、5、7、9 d对其叶绿素含量进行测定。

1.3 叶绿素含量的测定

采用丙酮乙醇提取法测定[23]，用剪刀将洗干净的待测叶剪碎，以增加萃取面积，准确称取0.1 g，放入15 mL的具塞三角瓶，然后再加入10 mLV（丙酮）∶V（乙醇）∶V（蒸馏水）=4.5∶4.5∶1的混合液，将其放置于4 ℃避光处浸提24 h，待材料变白充分浸提后过滤，取滤液在663 nm和645 nm波长下测定吸光度（A），按公式（1）～（4）计算叶绿素a含量（Ca）、叶绿素b含量（Cb）、叶绿素总量（Ca+b）、叶绿素a/b。

1.4 数据处理

不同历时干旱胁迫的数据为对应胁迫历时不同土壤干旱处理下的平均值，不同程度土壤干旱胁迫的数据为对应土壤干旱胁迫不同胁迫历时处理下的平均值，数据统计分析采用 Microsoft Excel和 SPSS软件结合进行，使用单因素方差分析来揭示不同历时干旱胁迫及不同程度土壤干旱胁迫后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响。使用双因素有重复方差分析，揭示不同历时和不同程度土壤干旱同时胁迫后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响；并运用Duncan检验方法来确定每个指标在各处理间差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 干旱胁迫对侧柏幼苗叶绿素含量的影响

由表1可知，侧柏幼苗在生长盛期Ca、Cb、Ca+b随着干旱胁迫时间的延长呈现缓慢下降的趋势，随着土壤干旱胁迫程度的加剧，呈现先降低再上升的趋势。其中干旱胁迫15 d土壤相对含水量为87.84%的侧柏幼苗Ca、Cb、Ca+b比CK降低11.5%、9.1%、11.1%，干旱胁迫60 d 土壤相对含水量为40%的侧柏幼苗Ca、Cb、Ca+b比CK降低15.4%、14.0%、15.1%。叶绿素a/b随着干旱胁迫时间的延长整体上呈现上升的趋势，随着土壤干旱胁迫程度的加剧逐渐下降。其中土壤相对含水量为52.16%干旱胁迫15、30、45 d的侧柏幼苗叶绿素a/b比CK分别降低4.2%、2.3%、1.2%，干旱胁迫60 d比CK高0.7%。各胁迫处理Ca、Cb、Ca+b及叶绿素a/b与CK差异显著（P＜0.05），其中干旱胁迫45 d和60 d与CK差异显著（P＜0.05）。说明随着干旱胁迫时间的延长和土壤干旱胁迫程度的加剧，侧柏幼苗在逐渐适应环境，并作出相应的生理响应。

表1 干旱胁迫程度对侧柏幼苗叶绿素的影响Table 1 Effects of drought stress on chlorophyll content of P. orientalis seedlings

2.2 不同历时干旱胁迫后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响

由表2可知，经过不同历时干旱胁迫后复水，侧柏幼苗Ca、Cb以及Ca+b整体上随着复水时间的延长而呈现出先升后降再升的趋势。复水第1天叶绿素含量高于复水前，第3天低于复水前，而第5天开始缓慢恢复出现了补偿现象。以干旱胁迫60 d的侧柏幼苗为例，Ca、Cb以及Ca+b在复水第9天比复水前分别增加了14.2%、16.8%和14.7%，不同历时的干旱胁迫处理后侧柏幼苗Ca、Cb以及Ca+b在复水前和复水后差异不显著。叶绿素a/b在复水后得到了恢复，其中复水第3天达到最大值，胁迫60 d的侧柏幼苗在复水第3天比复水前上升了26.3%，胁迫15 d的侧柏幼苗在复水第7天比复水前上升了5.0%。叶绿素a/b在复水第3天与复水前差异显著（P＜0.05），在其他复水时段与复水前无显著差异。可见，侧柏幼苗经过不同历时干旱胁迫后，叶绿素含量在逐渐适应环境的同时，随着复水时间的推移出现了补偿现象。

表2 不同历时干旱胁迫后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响Table 2 Effects of different duration of drought stress and rewatering on chlorophyll content of P. orientalis seedlings

2.3 不同程度土壤干旱胁迫后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响

由表3可知，侧柏幼苗在不同程度土壤干旱胁迫后复水，Ca、Cb以及Ca+b随着复水时间的延长逐渐上升，在复水第3天叶绿素含量总体上低于复水前，但基本恢复并高于CK，之后出现补偿现象。以土壤相对含水量为70%的侧柏幼苗为例，Ca、Cb以及Ca+b在复水第9天比复水前分别增加了13.2%、15.6%和13.7%。不同程度土壤干旱胁迫处理后侧柏幼苗Ca以及Ca+b在复水前和复水后差异不显著，低水分处理的侧柏幼苗Cb在复水第3天与复水前差异显著（P＜0.05）。叶绿素a/b在不同土壤水分胁迫后复水，呈现出先升后降再升的趋势，在复水第3天达到最大值，土壤相对含水量为40%的侧柏幼苗在复水第3天比复水前高21.6%。不同程度土壤干旱胁迫后复水叶绿素a/b差异显著（P＜0.05），其中复水第3天与复水前差异显著（P＜0.05）。

表3 不同水分胁迫后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响Table 3 Effect of rewatering on chlorophyll content of P. orientalis seedlings under different water stresses

2.4 干旱胁迫程度与历时互作后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响

由表4可知，经过不同历时和不同程度的土壤干旱同时胁迫后侧柏幼苗Ca+b呈现先降后升的趋势，复水后逐渐恢复。在复水第3天，除干旱胁迫60 d和45 d以及重度土壤水分胁迫外，其他处理均恢复至CK水平，复水第5天所有处理基本恢复CK水平；第7天开始出现补偿效应。其中干旱胁迫60 d土壤相对含水量为40%的处理在复水前比CK低15.1%，随着复水的进行，逐渐恢复，在复水第9天比CK高12.9%。干旱胁迫30 d土壤相对含水量为70%的处理在复水前比CK低6.4%，随着复水时间的延长逐渐恢复，在复水第9天比CK高34.9%，比复水前高20.4%。不同历时、不同程度土壤水分及二者同时胁迫下侧柏幼苗Ca+b的差异显著（P＜0.05），说明侧柏幼苗Ca+b在不同历时、不同程度土壤水分及二者同时胁迫的交互作用下具有显著差异（P＜0.05），因此不同历时、不同程度土壤水分及二者同时胁迫对侧柏幼苗Ca+b影响都较大。不同历时胁迫下，侧柏幼苗Ca+b差异显著（P＜0.05），尤其是在复水第5天开始差异显著（P＜0.05）；不同程度土壤水分胁迫下，相对含水量为52.16%和70%的处理与CK差异显著（P＜0.05），87.84%的处理在复水前和复水第1、5天与CK差异不显著，在复水第3、7、9天差异显著（P＜0.05），40%的处理在复水前和复水第3、5天与CK差异不显著，在复水第1天、第7天和第9天与CK差异显著（P＜0.05）。说明侧柏幼苗叶绿素含量受52.16%和70%的水分胁迫变化明显，而受87.84%和40%的水分胁迫变化不明显。

表 4 干旱胁迫程度与历时互作后复水对侧柏幼苗叶绿素含量的影响Table 4 Effect of rewatering on chlorophyll content of P. orientalis seedlings after interaction of drought stress and time

3 结论与讨论

干旱胁迫是常见的自然灾害，是植物生长过程中遇到的主要非生物胁迫，土壤干旱导致植物生理代谢活动降低[24]。因此，研究干旱胁迫对植物的抗旱性响应和旱后复水对植物的恢复机制同样重要[25-26]。适度的干旱胁迫后复水能使植物快速恢复其生长，从而减少干旱胁迫对其造成的损失，有时会产生超补偿效应来弥补前期干旱对植物产生的影响。植物叶绿素是植物进行光合作用的主要色素，其含量高低直接影响光合作用的强弱，因此，测定叶绿素含量的变化是研究光合作用的重要手段[27]。Ca是天线色素，也是参与光反应的主要色素，Cb是构成捕光天线复合体（LHC）的重要组成部分，具有吸收和传递光能的作用，在调控光合机构天线的大小、维持LHCⅡ的稳定性及对各种环境的适应等过程中都起作用。叶绿素a/b和叶绿素总量对植物光合作用也有一定的影响，其值随温度和光照强度的变化而改变[28]。

侧柏幼苗叶绿素a/b随着干旱胁迫时间的延长整体上呈现上升的趋势，随着土壤干旱胁迫程度的加剧逐渐下降。Ca、Cb以及Ca+b随着干旱胁迫时间的延长呈现缓慢下降的趋势，随着土壤干旱胁迫程度的加剧，呈现先降后升的趋势，这与初江涛等[7]、邹朋[18]、赵瑾等[29]的研究结果一致。说明随着干旱胁迫时间的延长和土壤干旱胁迫程度的加剧，侧柏幼苗在逐渐适应环境，并作出相应的生理响应。目前关于旱后复水对侧柏幼苗的影响已有很多研究，但多集中在生长、水分生理、活性氧及光合作用的方面，而对叶绿素含量的研究几乎没有[30-32]。不同历时及不同程度土壤干旱同时胁迫后复水，侧柏幼苗叶绿素含量随着复水时间的推移逐渐恢复，并在第7天开始出现补偿效应。侧柏幼苗Ca、Cb以及Ca+b经过不同历时的干旱胁迫及不同程度土壤干旱胁迫后，随着复水时间的延长，逐渐恢复并出现补偿效应，复水后叶绿素a/b呈现出先升后降再升的趋势，这与曹丹等[33]和张红萍等[34]的研究结果一致。表明侧柏幼苗耐旱性强，经过干旱胁迫后，幼苗能对复水做出及时的响应，随着复水时间的延长，侧柏幼苗能很快的恢复并出现补偿效应。

叶绿素含量变化与Ca的变化一致，由于Cb含量较少，因此，Ca含量的变化是引起叶绿素含量变化的主要因素。叶绿素a/b的波动幅度与Ca及Ca+b的波动幅度相反，而与Cb的波动幅度一致，虽然Cb的含量很少，但是在调节叶绿素a/b比值时起到了关键的作用。土壤相对含水量为40%的重度胁迫解除后，随着复水时间的延长，叶绿素总量的恢复度逐渐上升，在复水第1天的恢复度为51.2%，到复水第9天其值增长到76.2%；土壤相对含水量为70%的中轻度胁迫解除后，恢复度从复水第1天的57.8%增长到第9天的85.5%。说明随着复水时间的推移，侧柏幼苗叶绿素含量在逐渐恢复。

综上所述，经过不同历时的干旱胁迫侧柏幼苗叶绿素含量逐渐下降，不同程度土壤干旱胁迫及二者同时胁迫使得侧柏幼苗叶绿素含量呈现先降后升的趋势。随着复水时间的推移，侧柏幼苗能及时做出响应，在复水第3天基本恢复并高于对照，之后出现补偿效应。虽然侧柏幼苗在复水后恢复过程比较迅速，但在复水后对不同程度干旱胁迫的恢复能力存在差异，说明旱后复水的恢复能力对侧柏幼苗应对干旱胁迫的作用突出。不同历时和不同程度土壤干旱胁迫及二者同时胁迫虽然对侧柏幼苗叶绿素含量有影响，但这种影响经过复水是可以弥补的，甚至会在复水第7天出现超补偿现象，所以适度的干旱胁迫后复水有利于侧柏幼苗的生长。这是侧柏能在干湿交替频繁发生的西部干旱半干旱地区生存的重要保障。