绞股蓝提取物通过调控lncRNA PICSAR对IL-1β诱导软骨细胞损伤的保护作用及机制研究

刘文斌，李艳兵，周焱涛

骨关节炎(osteoarthritis，OA)是一种随着年龄增长发病率逐渐增加的慢性关节疾病，其发病机制复杂，涉及氧化应激、软骨细胞凋亡、细胞外基质降解及滑膜炎性反应等[1-4]。近年来发现中医药治疗骨关节炎疗效确切，能够多靶点、多途径发挥治疗作用[5-6]。因此，开发可用于治疗骨关节炎的中药对改善患者生活质量具有重要意义。绞股蓝为绞股蓝属植物的全草，其含有多种无机元素等，研究报道绞股蓝皂苷提取物对痛风性关节炎相关的炎性疼痛发挥镇痛作用[7]。绞股蓝总苷颗粒可通过清除活性氧(reactive oxygen species，ROS)减轻大鼠胶原诱导性关节炎的症状。绞股蓝皂苷抑制白介素1β(interleukin 1β，IL-1β)诱导的人骨关节炎软骨细胞炎性反应[8]。然而绞股蓝提取物对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响及机制尚不清楚。研究发现长链非编码RNA(long non-coding RNA，lncRNA)在包括关节炎在内的各种自身免疫性疾病中起着关键作用[9]。研究报道lncRNA PICSAR在类风湿关节炎滑液中的表达明显升高，通过刺激miR-4701-5p促进成纤维样滑膜细胞的增殖、迁移和侵袭，进而造成关节破坏[10]。说明lncRNA PICSAR可影响关节炎的发生发展。然而lncRNA PICSAR对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响，及绞股蓝提取物是否调控lncRNA PICSAR也尚不清楚。因此，本实验旨在研究绞股蓝提取物对IL-1β诱导软骨细胞损伤的影响及机制是否与lncRNA PICSAR有关，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)细胞：人关节软骨细胞购自美国sciencell公司；(2)试药试剂：绞股蓝提取物(纯度>98%)购自南京道斯夫生物科技有限公司；DMEM培养基购自上海中乔新舟生物科技有限公司； IL-1β购自上海烜雅生物科技有限公司；细胞计数试剂盒8(cell counting kit-8，CCK-8)购自北京泰泽嘉业科技发展有限公司；凋亡检测试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取试剂盒购自美国Invent公司；丙二醛(malonaldehyde，MDA)水平检测试剂盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)活性检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；荧光定量PCR试剂盒购自上海研卉生物科技有限公司；(3)仪器设备：Multiskan FC酶标仪购自美国Thermo公司；FACS caliber流式细胞仪购自美国BD公司；VCX750超声波细胞破碎仪购自美国Sonics公司。

1.2 实验方法 2020年10月—2021年4月于湖北省恩施土家族苗族自治州中心医院进行实验。(1)软骨细胞用DMEM培养基在37℃的孵育箱中培养，取对数生长期细胞，正常培养的细胞作为对照(NC)组；用10 ng/ml的IL-1β作用软骨细胞(诱导软骨细胞模拟其损伤)作为IL-1β组，分别用浓度为5、10、20 μg/ml的绞股蓝提取物和10 ng/ml的IL-1β处理软骨细胞，记为绞股蓝提取物低、中、高剂量组；(2)将PICSAR抑制表达质粒及阴性对照转染至软骨细胞6 h后，用10 ng/ml的IL-1β处理24 h，记为IL-1β+si-lncRNA PICSAR组、IL-1β+si-con组，研究抑制lncRNA PICSAR对软骨细胞损伤的影响；将PICSAR过表达质粒及阴性对照转染至软骨细胞后6 h后，用20 μg /ml的绞股蓝提取物和10 ng/ml的IL-1β处理24 h，记为pcDNA-lncRNA PICSAR+高剂量组、pcDNA-con+高剂量组，研究绞股蓝提取物和lncRNA PICSAR对软骨细胞损伤的影响。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞活力：各组处理软骨细胞以2×103个/孔的密度接种在96孔板中，培养24 h，将10 μl的CCK-8溶液添加到每孔中，酶标仪检测各组细胞450 nm处的吸光度值(A)。

1.3.2 流式细胞术检测细胞凋亡：收集各组处理软骨细胞，用预冷的PBS漂洗2次，加入结合缓冲液(1×Binding Buffer)400 μl重悬，然后加入10 μl的Annexin V-FITC和PI混匀，避光孵育10 min；以流式细胞仪检测细胞凋亡率。

1.3.3 蛋白质印迹(Western-blot)法检测凋亡相关蛋白Cleave-caspase-3的表达：提取各组软骨细胞的总蛋白，定量后通过凝胶电泳分离蛋白，然后转至聚偏二氟乙烯膜上，封闭后加入裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cleave-caspase-3)多克隆抗体(1∶800)，4℃孵育过夜，加入山羊抗兔IgG-HRP(1∶2 000)室温孵育2 h，ECL发光液显影，成像后用Quantity One分析蛋白条带的灰度值，以Cleave-caspase-3/β-actin条带的比值作为蛋白相对表达水平。

1.3.4 酶联免疫吸附法(ELISA)检测氧化应激性指标MDA水平和SOD、CAT活性：收集各组培养48 h的细胞，超声10 min使细胞裂解，2 000 r/min离心20 min取上清，各项指标均严格按照试剂盒说明书进行操作。

1.3.5 实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测lncRNA PICSAR表达水平：提取各组细胞的总RNA，反转录成cDNA后以GAPDH为内参进行PCR扩增，循环条件为95 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共40个循环；lncRNA PICSAR上游引物序列：5'-GCTGAACTGCCTGGACTTTC-3'，下游引物序列：5'-GTCTGAGGAAGAGGCACCTG-3'；GAPDH上游引物序列：5'-TGTTGCCATCAATCACCCCTT-3'，下游引物序列：5'-CTCCACGACGTACTCAGCG-3'。相对表达量采用2-△△Ct法计算各组lncRNA PICSAR表达水平。

2 结 果

2.1 不同浓度绞股蓝提取物对IL-1β诱导的OA软骨细胞活力及细胞凋亡的影响 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞活力降低、凋亡率升高，Cleave-caspase-3表达水平升高(P<0.05)；与IL-1β组比较，绞股蓝提取物低、中、高剂量组软骨细胞活力依次升高、凋亡率依次降低，Cleave-caspase-3表达水平依次降低(P均<0.05)，见图1、表1 。

图1 不同浓度绞股蓝提取物对OA软骨细胞Cleave-caspase-3蛋白表达的影响

表1 不同浓度绞股蓝提取物对IL-1β诱导的OA软骨细胞活力及细胞凋亡影响的比较

2.2 不同浓度绞股蓝提取物对IL-1β诱导的OA软骨细胞氧化应激影响的比较 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞中MDA水平升高，SOD和CAT活性降低(P<0.05)；与IL-1β组比较，绞股蓝提取物低、中、高剂量组软骨细胞中MDA水平依次降低，SOD和CAT活性依次升高(P均<0.05)，见表2。

表2 不同浓度绞股蓝提取物对IL-1β诱导的OA软骨细胞氧化应激影响的比较

2.3 不同浓度绞股蓝提取物对lncRNA PICSAR表达比较 与NC组比较，IL-1β组软骨细胞中lncRNA PICSAR表达水平升高(1.00±0.10 vs. 2.68±0.17，P<0.05)；与IL-1β组比较，绞股蓝提取物低、中、高剂量组软骨细胞中lncRNA PICSAR表达水平依次降低(2.17±0.15、1.68±0.12、1.21±0.09),差异有统计学意义(F=254.805，P=0.000)。

2.4 抑制lncRNA PICSAR对IL-1β诱导的OA软骨细胞活力、细胞凋亡及氧化应激的影响比较 与IL-1β+si-con组比较，IL-1β+si-lncRNA PICSAR组lncRNA PICSAR表达水平、Cleave-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA水平均降低，软骨细胞活力及SOD、CAT活性均升高(P<0.01)，见图2，表3。

表3 抑制lncRNA PICSAR对IL-1β诱导的OA软骨细胞活力、细胞凋亡及氧化应激的影响

注：A.IL-1β+si-con组；B.IL-1β+si-lncRNA PICSAR组；Cleave-caspase-3.裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

2.5 lncRNA PICSAR过表达在绞股蓝提取物对IL-1β诱导的OA软骨细胞活力、细胞凋亡及氧化应激中的影响 与pcDNA-con+高剂量组比较，pcDNA-lncRNA PICSAR+高剂量组lncRNA PICSAR表达水平、Cleave-caspase-3表达水平、细胞凋亡率、MDA水平升高，软骨细胞活力及SOD、CAT活性均降低(P<0.05)，见图3、表4。

表4 过表达lncRNA PICSAR在绞股蓝提取物对IL-1β诱导的OA软骨细胞活力、细胞凋亡及氧化应激的影响

注：A.pcDNA-con+高剂量组；B.pcDNA-lncRNA PICSAR+高剂量组；Cleave-caspase-3.裂解的半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3

3 讨 论

骨关节炎是一种以关节软骨进行性退化为特征的骨关节疾病，软骨细胞是关节软骨中的唯一细胞，软骨细胞凋亡可直接导致关节软骨退变甚至钙化，影响关节功能[11-12]。研究表明氧化应激参与了骨关节炎的病理过程，氧化应激可促使软骨细胞凋亡甚至导致病理损伤[13-15]。本实验用IL-1β诱导软骨细胞模拟其损伤情况，结果显示，软骨细胞活力降低，凋亡率升高，MDA水平升高，SOD和CAT活性降低；表明IL-1β诱导了软骨细胞凋亡和氧化应激的产生。研究报道绞股蓝皂苷对过氧化氢诱导的成骨细胞氧化应激损伤具有一定的保护作用，并对损伤的成骨细胞有促进增殖分化的作用[16-17]。绞股蓝总苷通过提高血管内皮细胞抗氧化活性对血管内皮细胞损伤起保护作用[18]。绞股蓝皂苷通过同时抑制神经元氧化应激和炎性反应来预防过氧化氢诱导的视网膜神经节细胞凋亡[19]。以上研究表明，绞股蓝的有效成分皂苷具有抗氧化作用。为研究绞股蓝提取物对IL-1β诱导的软骨细胞损伤是否有影响，本实验用不同剂量绞股蓝提取物处理IL-1β诱导的软骨细胞，结果显示，软骨细胞活力升高，凋亡率降低，Cleave-caspase-3表达水平降低，MDA水平降低，SOD和CAT活性升高。Cleave-caspase-3是凋亡相关蛋白，其表达水平升高表明细胞凋亡增多，因此，本实验结果表明绞股蓝提取物可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和氧化应激。

研究表明，lncRNA参与调控骨关节炎软骨细胞损伤[20]。研究报道，lncRNA MALAT1通过调节miR-150-5p/AKT3轴促进软骨细胞增殖，抑制细胞凋亡和细胞外基质降解[21]。lncRNA NR024118过表达可抑制脂多糖诱导的软骨细胞凋亡、氧化应激和炎性反应[22]。而lncRNA PICSAR对IL-1β诱导的软骨细胞的影响尚不清楚。本结果显示，IL-1β诱导的软骨细胞中lncRNA PICSAR表达水平升高，提示lncRNA PICSAR可能参与软骨细胞损伤过程。进一步抑制lncRNA PICSAR表达后，软骨细胞活力升高，Cleave-caspase-3表达水平降低，细胞凋亡率降低，MDA水平降低，SOD和CAT活性升高；表明抑制lncRNA PICSAR表达可抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和氧化应激。过表达lncRNA PICSAR能够逆转绞股蓝提取物对IL-1β诱导的软骨细胞活力、细胞凋亡及氧化应激的影响。

综上，绞股蓝提取物通过下调lncRNA PICSAR抑制IL-1β诱导的软骨细胞凋亡和氧化应激，减轻IL-1β诱导的软骨细胞损伤。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

刘文斌: 设计研究方案，课题设计，实施研究过程，论文撰写;李艳兵:提出研究思路，分析试验数据，论文审核;周焱涛:实施研究过程，资料搜集整理，论文修改，进行统计学分析