京尼平苷对肺癌H1975细胞增殖和转移的抑制作用及SIRT1/NF-κB信号通路的影响

杨谦，张军，马玉泉，谭雪敏

肺癌是最危险的癌症之一，其生存率低于其他类型的恶性肿瘤，5年总生存率仅为10%～20%[1]。据报道，2018年新增肺癌病例210万，死亡180万[2]。尽管在手术、放疗、化疗和特定靶向治疗方面取得了进展，但由于诊断发现晚，导致其预后仍不理想，进而出现癌细胞的转移[3-4]。大量的基因组研究将肺癌与抑癌、致癌基因的表达、染色体畸变、氧化应激等因素相联系，这些因素影响了包括细胞生长、分裂、增殖、存活、运动、侵袭和细胞内追踪等多种细胞功能[5]。京尼平苷是一种环烯醚萜葡萄糖苷，主要用于心血管、消化系统和中枢神经系统疾病的治疗，有研究发现，京尼平苷对多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用[6]。沉默信息调节因子1(SIRT1)具有许多生物学作用，包括抑制细胞分化、调节细胞周期、抑制凋亡和肿瘤发生，有研究发现，SIRT1在一些癌症中的表达下调，包括乳腺癌、前列腺癌和肺癌[7]。SIRT1作为一种依赖烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)的组蛋白去乙酰化酶，具有非常广泛的底物，不仅与组蛋白H1、H3和H4相互作用和调节，而且还与非组蛋白底物，如核因子-κB(NF-κB)、肿瘤抑制因子p53、叉头框转录因子(Fox)和DNA修复因子E2F转录因子1(E2F1)蛋白质类相互作用[8]。然而，SIRT1在肺癌发展中的确切作用尚不清楚。因此，本研究重点探讨京尼平苷对肺癌H1975细胞增殖和转移的影响，为肺癌的临床治疗提供参考，报道如下。

1 材料与方法

1.1 材料 (1)实验细胞：肺癌H1975细胞株(武汉普诺赛生命科技有限公司)；(2)药物试剂：京尼平苷(上海万疆生物技术有限公司，原料药，纯度≥98%)；多柔比星(武汉市东康源科技有限公司，原料药，纯度99%)； RPMI 1640培养基(美国Gibco公司)；细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、牛血清白蛋白(BSA)、蛋白裂解液、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶(上海优宁维生物有限公司)；鼠抗人SIRT1、NF-κB、β-actin一抗(美国abcam公司)；鼠抗人二抗(美国Invitrogen公司)。(3) 仪器：Herocell 180型CO2细胞培养箱(上海润度生物科技有限公司)，DG5033A型酶标仪(南京华东电子信息科技股份有限公司)，353097型Transwell小室(北京冬璞泰和科技有限责任公司)，TA500型显微镜(德国徕卡公司)，LAS-4000型凝胶成像系统(美国GE公司)。

1.2 实验方法 2021年1—2月在邯郸市中心医院实验室进行实验。

1.2.1 细胞培养：肺癌H1975细胞复苏后，将其置于含有10% FBS、青霉素(100 μg/ml)和链霉素(100 μg/ml)的RPMI 1640培养基中，在5%CO2、37℃培养箱中静置培养，每24 h更换一次培养液，并在细胞覆盖率达到70%左右时使用胰蛋白酶消化、传代。

1.2.2 细胞分组及处理：将培养后的肺癌H1975细胞分为阴性对照组及京尼平苷低、中、高剂量组和阳性对照组[9-10]。阴性对照组：将肺癌H1975细胞5×105个/ml在RPMI 1640培养基中培养(培养环境5%CO2、2%O2、93%N2，37℃)；京尼平苷低、中、高剂量组：将京尼平苷10、20、40 μmol/L添加至肺癌H1975细胞的培养基中培养，方法同阴性对照组；阳性对照组：将多柔比星10 μmol/L添加至肺癌H1975细胞的培养基中培养，方法同阴性对照组。各组设置6个平行样，均培养72 h。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 CCK-8法检测细胞存活率：上述各组肺癌H1975细胞胰蛋白酶消化2 min，制作成细胞悬液，离心弃上清，加入含10% FBS的RPMI 1640培养基，使细胞悬浮，接种到96孔板中，每孔100 μl，培养24 h后去除培养液，再加入新的RPMI 1640培养液，培养24 h，去除培养液。每孔加入RPMI 1640培养液100 μl和 CCK-8试剂10 μl，持续培养3 h，使用酶标仪读取450 nm处的吸光度(OD)值，计算细胞存活率，细胞存活率=实验组OD值/空白组OD值×100%。只加培养液、CCK-8试剂设为空白组。

1.3.2 Transwell小室测定细胞侵袭能力：将上述各组细胞接种到涂有基质胶的Transwell小室上层，10%的FBS作为趋化剂添加到下腔室中，在37℃下孵育24 h后，对滤膜进行结晶紫染色，显微镜下对细胞进行观察，随机选择5个视野进行细胞计数(紫色细胞数量)，重复3次取平均值。

1.3.3 划痕实验法检测细胞迁移能力：将上述各组肺癌H1975细胞以5×105个/孔的密度接种在培养板上黏附过夜，细胞密度在95%左右时，进行 200 μl枪头划痕，并在培养24 h后观察细胞迁移，在划痕0 h和24 h后使用显微镜获得刮擦的图像，检查划痕间隙，计算细胞迁移率，细胞迁移率=(0 h间隙距离-24 h间隙距离)/0 h间隙距离×100%[11]。

1.3.4 蛋白免疫印迹法检测SIRT1、NF-κB蛋白表达：用超声波细胞破碎仪使细胞破碎，采用蛋白裂解液裂解细胞，收集细胞裂解液离心，上清液即为总蛋白，经凝胶电泳分离后，将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，将膜放在5%脱脂奶粉溶液中封闭2 h，然后用鼠抗人SIRT1(1∶1 000)、NF-κB(1∶1 000)、β-actin(1∶1 000)一抗在4℃条件下孵育2 h，PBS缓冲液清洗3次，加入二抗孵育2 h，采用化学发光试剂并在凝胶成像系统上显影SIRT1、NF-κB和β-actin的蛋白条带，并分析结果。

2 结 果

2.1 各组肺癌H1975细胞存活率比较 与阴性对照组比较，京尼平苷各剂量组与阳性对照组细胞存活率显著降低，且京尼平苷低剂量组>中剂量组>高剂量组(P<0.05)；京尼平苷高剂量组和阳性对照组细胞存活率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1。

2.2 各组肺癌H1975细胞侵袭细胞数比较 与阴性对照组比较，京尼平苷各剂量组与阳性对照组侵袭细胞数显著降低，且京尼平苷低剂量组>中剂量组>高剂量组(P<0.05)；京尼平苷高剂量组和阳性对照组侵袭细胞数比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图1。

图1 各组肺癌H1975细胞侵袭细胞数比较(结晶紫染色，×200，箭头表示侵袭细胞)

2.3 各组肺癌H1975细胞迁移率比较 与阴性对照组比较，京尼平苷各剂量组与阳性对照组细胞迁移率显著降低，且京尼平苷低剂量组>中剂量组>高剂量组(P<0.05)；京尼平苷高剂量组和阳性对照组细胞迁移率比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表1、图2。

图2 各组肺癌H1975细胞迁移率比较

表1 各组肺癌H1975细胞存活率、侵袭细胞数、细胞迁移率比较

2.4 各组肺癌H1975细胞SIRT1、NF-κB蛋白表达水平比较 与阴性对照组比较，京尼平苷各剂量组及阳性对照组SIRT1蛋白表达水平显著升高，NF-κB蛋白表达水平显著降低，且京尼平苷各剂量组随剂量增加SIRT1蛋白表达水平升高，NF-κB蛋白表达水平降低(P<0.05)；京尼平苷高剂量组和阳性对照组SIRT1、NF-κB蛋白表达比较差异无统计学意义(P>0.05)，见表2、图3。

注： A.阴性对照组；B.京尼平苷低剂量组；C.京尼平苷中剂量组；D.京尼平苷高剂量组；E.阳性对照组

表2 各组肺癌H1975细胞SIRT1、NF-κB蛋白表达水平比较

3 讨 论

肺癌仍然是全世界癌症相关死亡的主要原因[12]。其中肺腺癌、鳞状细胞癌和大细胞肺癌占全部肺癌病例的75%[13]。在中国，肺癌目前在所有癌症中的发病率为第一位，同时也是病死率最高的恶性肿瘤[14]。

近50年来，在多个国家肺癌的发病率均呈上升趋势，同时城市发病率高于农村，经济较发达地区发病率较高[15]。由于临床常规药物治疗的局限性和毒副作用，限制了肺癌的治疗，因此了解和评价其具体作用机制，寻找有效的、安全的肺癌治疗方法是一个迫切的问题。京尼平苷为一种环烯醚萜类化合物，具有抗炎、镇痛、止泻、抑制胃酸分泌、治疗软组织损伤等功效[16]。有研究发现，京尼平苷对乳腺癌细胞的增殖具有明显的抑制作用，并可降低其迁移水平[17]。本研究中选用的肺癌H1975细胞属于肺腺癌细胞，结果发现，在给予京尼平苷干预后，可明显抑制其增殖、迁移和侵袭水平，且随着京尼平苷干预剂量的增加，其抑制效果更明显，具有剂量—效应关系，表明京尼平苷对肺癌H1975细胞作用明显，可能在肺癌的治疗过程中起到一定的作用。

SIRT1是sirtuin家族的一员，在哺乳动物细胞应激反应和细胞命运决定中起着重要作用，它能使核心组蛋白N端尾部的赖氨酸残基脱乙酰，导致DNA卷曲，随后转录降低[18-19]。最近的研究还表明，SIRT1在包括肺癌在内的多种癌细胞中低表达，并且SIRT1的表达可能通过与叉头框蛋白O(FOXO)、B细胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、肿瘤抑制因子p21、肿瘤抑制因子p53、蛋白激酶B(AKT)和共济失调毛细血管扩张症突变基因(ATM)的相互作用而与化疗和放疗的耐受性相关[20]。NF-κB是SIRT1的下游底物之一，NF-κB通过抗凋亡信号保护细胞免于死亡[21]。已有研究发现SIRT1和NF-κB的表达水平在多种肿瘤中均发生异常，其表达水平与肿瘤细胞的转移水平密切相关[22-23]。在本研究中，探讨了SIRT1通过SIRT1/NF-κB途径调节肺癌H1975细胞的增殖和转移。在阴性对照组中，SIRT1呈现低表达状态，而SIRT1低表达可促进NF-κB的表达，从而导致NF-κB在肺癌H1975细胞中为高表达状态，当给予京尼平苷干预后，SIRT1表达上调，NF-κB表达下降，同时结合肺癌H1975细胞存活率、侵袭力和迁移力的结果，发现其增殖、侵袭和转移水平均受到抑制，因此推测京尼平苷可能通过SIRT1使组蛋白去乙酰化降低NF-κB的表达，从而导致肺癌H1975细胞免受NF-κB的抗凋亡作用，抑制肺癌H1975细胞的增殖，同时降低了肺癌H1975细胞的侵袭力和迁移力，达到降低肿瘤细胞转移的风险。

综上所述，京尼平苷可有效抑制肺癌H1975细胞的增殖和转移，其作用效果与剂量密切相关，京尼平苷的抗增殖和转移作用可能与调控SIRT1/NF-κB信号通路有关，可能通过促进SIRT1蛋白的表达来抑制其下游蛋白NF-κB的表达，从而抑制肺癌H1975细胞的增殖和转移。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

杨谦：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；张军：提出研究思路，分析试验数据，论文审核；马玉泉：实施研究过程，资料搜集整理，论文修改；谭雪敏：进行统计学分析，课题设计