培养基对抗生素效价测定的影响

林常定

（文山州食品药品检验研究院微生物检测科 云南 文山 663099）

当前测量抗生素效价作为微生物的主要鉴定方式，是关键的检测的测量方法[1]。当前影响抗生素效价测量的因素较多，包括仪器精准度、培养基等因素，且微生物的生长繁殖都需具备一定的条件，才能满足实际的需求[2]。基于此，本文针对培养基对抗生素的效价测定影响进行分析，并简单概述抗生素效价测量过程中各项影响因素，详细内容如下。

2.结果

实验结果显示，对抗生素使用不同培养基进行测定时，同一生产商家的培养基对一个样品进行多次测量的结果，两次测量结果之间的数据差1%～5%，而不同商家的培养基测量数据时，其数据差大于5%。详细见表1、表2。

表1 培养基与供试样品

表2 效价测定结果（%）

1.资料与方法

1.1 标准品、实验用菌液制备

标准品：庆大霉素：采用经中国药品生物制品检定所批准后的庆大霉素进行实验，庆大霉素批号为130326-200314。

试验品应用菌液的制备：实验菌主要采用短小芽孢杆菌悬浮液，采用普通琼脂斜面培养物，并添加灭菌0.9%氯化钠溶液将菌苔洗下，随后制作成悬浮液，使用吸管将其放置盛有培养基的大试管斜面内，让其在37 ℃环境下培养一周。一周后获取菌苔涂片，对其进行革兰氏染色镜检，保证芽孢在85%以上，并使用灭菌水将芽孢清洗下去，随后制成芽孢悬浮液，将其转移至灭菌大试管内，让其在70 ℃环境下，对其加热30 min 后，将芽孢悬浮液移动至灭菌离心管内，对其离心处理后，获得悬浮液。将悬浮液转移至灭菌试管内，在此将其放置于70 ℃环境下水浴加热30 min，并放置在4 ～8 ℃环境内保存，其可以使用6 ～12 个月。

1.2 培养基、供试样品

培养基采用青岛海博生物生产的抗生素培养基以及进出口商品检验技术研究所采购的抗生素培养基。实验应用的抗生素样品包括四种不同厂家的庆大霉素药物，分别为山东鲁抗医药集团赛特有限责任公司生产的硫酸庆大霉素注射液（国药准字H370224046）、湖北广济药业股份有限公司生产的硫酸庆大霉素颗粒（国药准字H42022713）、重庆迪康长江制药有限公司生产的硫酸庆大霉素胶囊（国药准字H50021682）、江苏平光制药（焦作）有限公司生产的硫酸庆大霉素片（国药准字H20023352）。

3.讨论

抗生素含量测量的主要方法是微生物测量方法，且各个药物均具有一定的记载[3]。微生物检测的方法直接关系到使用人员的安全性以及有效性，且检测原理与临床医疗的要求相似，可以代表抗生素对微生物产生的作用，进而保证实验结果更加准确[4]。

3.1 培养基

微生物检定法中培养基的质量具有十分重要的地位，其不仅影响细菌的生长繁殖，还会降低抗生素的实际浓度，进而影响抗生素的扩散系数以及时间[5]。此种情况下，抗生素的抑菌圈直径大小以及边缘清晰度、实验结果准确性，都会影响实际的情况。培养基成品中主要以陈和琼脂培养基的影响最大，故对抗生素进行效价检测之前，需选择品牌一致的生产商进行实验[6]。

同时，抗生素培养基微生物检定过程中，常使用固体培养基等。成品抗生素培养基的PH 数值普遍偏低，进而对细菌生长速度以及抗生素的扩散产生一定的影响。相关文献研究，部分抗生素，尤其是包含氨基糖苷类抗生素可以通过增加培养基的酸碱度，提高检测准确度。比如，磷霉素的微生物检测方法的酸碱数值为9.0 的培养基，可以在不改变其他检测条件下，检测结果满足微生物检测要求，保证实际检测的结果。

3.2 实验用菌影响

首先，实验需保证菌种优化。实验人员合理选择菌种，是建立微生物生物检定法的关键方法，其具有一定的临床特定，其对抗生素具有敏感、稳定等特点，且具有易于保存、培养等特点。处于此种情况下，实验人员需要挑选具有典型症状的单个菌落，并对其进行分离纯化培养等措施。为了保证菌种的新鲜程度，需每间隔2 ～3 周对其进行1 次传代处理。针对不常使用的菌种，其接种时，需固定在半固定体培养基内或进行冻干保存。

其次，实验菌群的菌龄对于抑菌圈的边缘清晰程度具有密切的联系。部分学者对这一内容进行深入研究发现，当天菌的抑菌圈边缘较清晰，15 d 菌龄的抑菌圈边缘也比较清晰，30 d 菌龄的抑菌圈边缘也尚可，5 mo 菌龄的抑菌圈边缘则不清晰。使用菌液对其进行清洗之后，将其放置与灭菌注射用水中，不超过3 mo 为宜。若在应用菌群的过程中，发现抑菌圈边缘不够规整，可以用65 ℃对其进行加热，进而获得满意的效果。

最后，培养基温度比较高会杀灭一些试验菌群，进而导致抑菌圈发生破裂的情况。通常情况下，菌群培养基的温度需控制在65 ～70 ℃，球菌培养基的温度需控制在48 ～50 ℃，霉菌培养基的温度则不宜超过48 ℃。

3.3 缓冲液pH 影响

缓冲液的pH 浓度只作为控制抑菌圈大小以及清晰度的关键条件。正常情况下，碱性抗生素在偏碱性缓冲液条件下其具有较强的抗菌液，酸性抗生素处于偏酸性条件下的抗菌活性比较强。氨基糖苷类以及大环内酯类等碱性抗生素，需选用偏碱性的缓冲液，以此提高抗生素的抗菌活性。比如，庆大霉素的微生物检测过程中，高剂量的抑菌圈直径常不到18 ～24 mm，且高低直径抑菌圈直径相差比较小，且抑菌圈边缘欠清晰，对其使用卡尺进行测量，无法保证实际的误差，更不能对抑菌面积测量分析仪器进行直接的测量。

3.4 培养温度影响

药典对抗生素的培养温度以及时间均有详细的记录，培养的温度过高或者过低的时候，都会影响抑菌圈的大小以及完整度。通常，靠近孵化箱较近一侧培养基上的细菌，其生长速度较快。此种情况下，极易出现局部生长速度不平衡的情况，且抑菌圈比较小。

3.5 测量结果影响

测量抑菌圈直径是获得时间结果的关键环节。当前，国内抗生素培养基结果测量，常使用游标卡尺进行测量，并在测量过程中，保持视线与读数刻度垂直，以此保证读数的准确性。并且，反复多次测量一个抑菌圈之后，需要将卡尺退回至零点或者进行移动，随后测量两个抑菌圈，避免发生主观上的视觉错误，进而影响客观数据。同时，使用卡尺进行测量的过程中，可以采用十字交叉测量方法，对每个抑菌圈进行两次垂直测量，获得平均数值，且两次测量之间的抑菌圈直径数据差不能超过0.1 mm。

3.6 标准品影响

抗生素生物检定法应用的标准品的性质，主要是根据抗生素的效价精准度以及性质，对其进行合理的判定。部分制剂内含有较大抗菌活性的添加剂，需在添加标准品溶液内，添加相同数量添加剂，以此消除测定对产生的影响。一些对光敏感或者在水溶解度比较差的抗生素。实验人员在实际制备的过程中，还需注意避光措施，以此保证溶液以及供试液中所含浓度相同，降低影响。

综上所述，在抗生素微生物检定法实验中，从标准品、供试品等各个环节，直至培养基、缓冲液配置以及实验菌种等操作中，实验人员需严格遵守操作规范。实验人员在实际工作中，经常会碰到抑菌圈破裂、卵圆形、椭圆形等情况。通过对其进行多个方面的分析后，可以重新选择一个批号或者另一厂家的培养基，进而保证实验结果的满意度。同时，实验操作人员在配置过程中，培养基以及缓冲液内的纯化水也具有关键作用。由于各地水质的酸碱程度不一样，需根据药典规定严格制定合理的内容，进而保证实验数据有效。比如，氨基糖苷类抗生素检测过程中，培养基、缓冲液等酸碱程度对抑菌圈的影响比较大，酸碱程度比较高培养基，获得抑菌圈则越小。因此，针对检测效价处于合格、不合格边缘的抗生素药品，需要更换厂家、批号对其进行实验，随后对实验结果展开对比，获得精准的实验数据内容。