酪蛋白酸钠美拉德反应产物制备工艺优化

王博，于景华*

1. 甘肃工业职业技术学院（天水 741025）；2. 天津科技大学（天津 300457）

美拉德反应（Millard reaction）主要是反应体系中的羰基化合物（还原糖类）和氨基化合物（氨基酸和蛋白质）之间经缩合、聚合生成类黑色素的反应，也被称为羰氨反应[1]。美拉德反应对食品生产具有重要的意义。程传玲等[2]利用山梨糖与脯氨酸的美拉德反应产物为卷烟增香；刘丹等[3]利用美拉德反应产生的肉类特征风味为兔肉增香。周张涛等[4]筛选出果糖是通过美拉德反应制备浓香葵花籽油的最佳还原糖单糖，并优化了浓香葵花籽油的制备工艺。美拉德反应产物中还存在一些具有多种生物学活性的低分子量化合物，国内外学者对美拉德反应产物的功能特性进行了深入的研究，包括抗氧化性、提高蛋白质的溶解性和乳化性、降低蛋白质过敏反应，抑菌、抗过敏、抗突变、保护心血管疾病和预防肠道炎症等[5-6]。陈正军等[7]用湿法制备的酪蛋白酸钠与低聚异麦芽糖的美拉德反应产物抗氧化性能较强，能有效保护芯材成分，以其为壁材制备的混合油脂微胶囊具有良好的理化特性。Bi等[8]利用干法得到β-乳球蛋白与阿拉伯胶的美拉德反应产物，用其作为乳化剂制备的乳状液在低pH和高盐离子浓度下具有较好的稳定性。Li等[9]利用大米蛋白水解物与葡聚糖制备出的美拉德反应产物对大米蛋白的溶解性和乳化性有显著改善。Dong等[10]发现利用干法反应72 h后得到的亚麻籽胶和乳清蛋白的美拉德反应产物在油水乳状液中表现出良好的乳化性。

酪蛋白酸钠是牛乳中主要蛋白质酪蛋白的钠盐，作为一种安全无害的乳化剂和增稠剂，被广泛地应用于食品行业。GB/T 2760—2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[11]指出酪蛋白酸钠可作为二十二碳六烯酸（DHA）和花生四烯酸（ARA）的载体添加到婴幼儿配方食品中；葡萄糖是生物体内新陈代谢不可缺少的营养物质，是人类生命活动所需能量的重要来源，被广泛应用于食品、医药工业[12]。酪蛋白酸钠-葡萄糖的美拉德反应产物可作为多功能添加剂应用到食品功能因子输送体系中。但根据前人的研究成果，在实验室小试的条件下制备美拉德反应产物所需的加热时间较长，不利于工业化生产，此次研究利用实验室超高温杀菌机进行小试的放大试验，在制备美拉德反应产物的同时还可对产品进行杀菌；超高温杀菌机可与均质机、分离机、闪蒸机等设备相连，可实现连续化生产；在避免水浴、油浴等试验方法弊端、提高生产效率的同时获得了工业生产所需的实验数据，加速和推进实验室成果走向工业化生产。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酪蛋白酸钠、葡萄糖（美国Sigma公司）；Life’sTMDHA S35-O300藻油（荷兰皇家帝斯曼集团）；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

T25 Digital高速剪切仪（德国IKA公司）；AH100D高压均质机（ATS工业系统有限公司）；SPAKK酶标仪（TECAN公司）；Turbiscan AGS稳定性分析仪（法国Formulation公司）；实验室超高温杀菌机（北京博华精远科技开发有限公司）。

1.3 酪蛋白酸钠-葡萄糖美拉德反应产物的制备

配制质量分数为5%的酪蛋白酸钠（NaCN）溶液，充分水合后按一定质量比向其加入葡萄糖（glu），充分溶解后用0.2 mol/L NaOH调节起始pH；利用实验室超高温杀菌机在一定温度下热处理一定时间，得到酪蛋白酸钠-葡萄糖美拉德反应产物（NaCN-glu），于-20 ℃冷冻备用。

1.4 美拉德反应产物乳化活性的测定

NaCN-glu的乳化活性测定参照Pearce等[13]的方法，略做改动。取20 mL制备好的NaCN-glu溶液于50 mL烧杯中，加入2% DHA藻油，在中等剪切速度下剪切1 min，立即从烧杯底部吸取50 mL浊液，用0.1%SDS溶液定容至5 mL，涡旋后在500 nm处测定吸光度A，表示NaCN-glu的乳化活性，以0.1% SDS溶液为空白。

1.5 中试条件下美拉德反应产物制备工艺的单因素试验设计

溶液起始pH：在酪蛋白酸钠的浓度为5%（W/W）的条件下，固定蛋白质-糖质量比1∶1（W/W）、热处理温度130 ℃、反应时间15 s，考察溶液在不同起始pH（7.0，7.5，8.0，8.5和9.0）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

热处理温度：在酪蛋白酸钠的浓度为5%（W/W）的条件下，固定溶液起始pH 8.0、酪蛋白酸钠-葡萄糖的质量比1∶1（W/W）、反应时间15 s，考察在不同热处理温度（100，110，120，130和140 ℃）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

反应时间：在酪蛋白酸钠的浓度为5%（W/W）的条件下，固定溶液起始pH 8.0、蛋白质酪蛋白酸钠-葡萄糖的质量比1∶1（W/W）、热处理温度130℃，考察在不同反应时间（5，10，15，20和30 s）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

底物配比：在酪蛋白酸钠的浓度为5%（W/W）的条件下，固定溶液起始pH 8.0、热处理温度130℃、反应时间15 s，考察酪蛋白酸钠与葡萄糖在不同的质量比（2∶1，1∶1，2∶3，1∶2和1∶3）下生成的NaCN-glu的乳化活性。

1.6 中试条件下美拉德反应产物制备工艺的正交试验设计

根据单因素的试验结果，以乳化活性为评价指标，选择热处理时间（A）、热处理温度（B）和底物配比（C）三个因素按正交表L16(43)进行试验，正交试验的因素与水平见表1。

表1 正交试验因素水平表

1.7 DHA藻油乳状液的制备及稳定性快速评价

以上一步得到的NaCN-glu溶液作为水相，向其缓慢加入10%的DHA藻油（油相），在中等剪切速度下剪切3 min得初乳状液，然后经高压均质机在（35±5）MPa下均质3次得到最终的乳状液，迅速冷却至室温；在相同的条件下以未经美拉德反应的酪蛋白酸钠作为乳化剂制备DHA藻油乳状液作为空白对照。利用Turbiscan AGS稳定性分析仪对乳状液的稳定性进行快速分析[14]。取1.7中制备的乳状液各20 mL于样品瓶中，将样品瓶放入检测池中，温度设定25 ℃，每1 h扫描1次，扫描24 h，记录扫描图谱。试验重复测定3次。

1.8 统计分析

采用SSPS 20.0软件对数据进行处理，结果以x±s表示。采用单因素方差分析来分析组间差异性，以p＜0.05表示差异显著，使用软件Origin 8.0绘图。

2 结果与分析

2.1 起始pH对美拉德反应产物乳化特性的影响

美拉德反应在碱性条件下更容易发生，当反应体系的pH大于3时，反应速率随pH升高而加快，但pH过高，反应速率则难以控制，导致蛋白质、糖或中间产物降解成小分子物质。在此次试验中，当反应体系的起始pH大于8时，得到的NaCN-glu的乳化能力有轻微下降的趋势。尽管酪蛋白酸钠在等电点时的乳化力最小，在碱性条件下其乳化力显著增大，但在婴幼儿配方奶粉等食品的实际生产过程中，应尽量使体系的pH保持在中性范围，否则会影响食品中其他蛋白的稳定性，所以选择反应体系的起始pH 8.0，反应结束后溶液的pH在7.6左右，较为合理。

图1 pH对NaCN-glu乳化活性的影响

2.2 热处理温度对美拉德反应产物乳化特性的影响

热处理温度对美拉德反应影响显著，从而对NaCNglu的乳化活性产生影响。热处理温度相差10 ℃，褐变速率相差3~5倍[1]。由图2可知随热处理温度的升高，NaCN-glu的乳化活性先增大后减小，130 ℃时达到最大0.63，显著高于其他热处理温度（p＜0.05）。低温时美拉德反应速率较慢，当温度升高到140 ℃以上时，反应速率过快，不易控制，热处理15 s后溶液的颜色已明显加深，可能已经进入美拉德反应后期生成类黑精物质，影响产物的乳化特性。所以选取130℃为热处理温度，再进行下一步筛选。

图2 热处理温度对NaCN-glu乳化活性的影响

2.3 热处理时间对美拉德反应产物乳化特性的影响

由图3和图4可知，随热处理时间的延长，NaCNglu的乳化活性先增大后减小，15 s时达到最大，当热处理时间超过15 s时，结合在蛋白质上的糖分子数过多，NaCN-glu过度亲水使其在油-水界面的吸附能力下降，同时体系内发生环化和降解等反应导致美拉德反应产物的相对分子质量差别逐渐增大，相对分子质量的两极分化会对蛋白质的乳化能力造成不良影响，从而对产物的乳化能力造成不利的影响。所以为得到较高乳化活性的美拉德反应产物，应控制美拉德反应程度，在此次试验条件下，选取热处理时间15 s。

图3 热处理时间对NaCN-glu乳化活性的影响

2.4 底物配比对美拉德反应产物乳化特性的影响

由图5可知，随体系中葡萄糖浓度的增大，NaCNglu的乳化活性先增大后减小。当酪蛋白酸钠与葡萄糖的质量比由2∶1减小到1∶1时，NaCN-glu的乳化活性增长极为显著（p＜0.01），这是因为平均每个酪蛋白分子上有14个氨基（包括N端氨基），可与葡萄糖的还原端羰基发生反应，当反应体系内的葡萄糖浓度增加，可以提供更多的羰基时，与酪蛋白酸钠结合的葡萄糖更多，得到的羰氨产物使体系的乳化活性升高。但若体系内的葡萄糖过多，随热处理时间的延长，酪蛋白酸钠分子部分伸展使内部的ε-氨基逐渐暴露在分子表面，羰基与氨基进一步缩合使结合在蛋白质上的亲水基过多，不能平衡油水界面的张力，导致乳化活性有明显的下降。综上所述，选择底物配比1∶1较为合适，从生产成本角度考虑也更为经济合理。

图5 底物配比对NaCN-glu乳化活性的影响

2.5 正交试验结果分析

通过单因素试验确定了对NaCN-glu乳化活性影响较大的三个因素及其范围，即热处理时间（A）、热处理温度（B）和底物配比（C）。在酪蛋白酸钠浓度5%（W/W）、起始pH 8.0的条件下，以乳化活性（EA）为评价指标，按正交表L16(43)设计正交试验，考察三个因素对NaCN-glu乳化活性的综合影响，确定酪蛋白酸钠-葡萄糖美拉德反应的最佳制备工艺，正交试验结果和方差分析见表2和表3。

表2 正交试验设计与结果

根据极差R的大小可知各因素对NaCN-glu的乳化活性影响的顺序为C＞B＞A，即底物配比＞热处理温度＞热处理时间。由表3方差分析的结果可以看出，底物配比对NaCN-glu的乳化活性影响极显著，热处理温度影响显著，热处理时间影响不显著。综合直观分析与方差分析的结果，确定了制备高乳化活性的NaCN-glu的最优组合A3B4C2，即热处理时间15 s，热处理温度130 ℃，酪蛋白酸钠与葡萄糖的底物配比1∶1（W/W）。

表3 正交试验结果方差分析

2.6 验证试验

根据正交试验得到的最佳的酪蛋白酸钠美拉德反应产物制备工艺，即在酪蛋白酸钠的浓度5%（W/W）、起始pH 8.0的条件下，酪蛋白酸钠与葡萄糖的质量比为1∶1（W/W），130 ℃热处理15 s制备的酪蛋白酸钠-葡萄糖美拉德反应产物的乳化活性为0.64，优于正交试验结果，说明优化工艺可靠。

2.7 DHA藻油乳状液的稳定性

Turbiscan AGS稳定性分析仪采用近红外作为光源，与透射光检测器和背散射光检测检测器组成测量探头，对样品池从底部到顶部每40 μm扫描1次，在一定时间内连续扫描，获得透射光与背散射光信号对样品高度的函数曲线图，即可反映出样品中颗粒的运动趋势，进而预测出乳状液的稳定性。

此次试验所制备的DHA藻油乳状液总固形物含量较高，几乎没有透射光，所以选择背散射光对样品进行分析。图6（a）和（b）分别为试验组NaCN-glu和对照组NaCN的背散射光光强随时间变化的扫描图谱，图中横坐标从左到右代表样品瓶底部、中部和顶部，纵坐标为背散射光光强的变化情况（以第一次扫描结果为参比）。由图6可知，两样品均呈现底部的背散射光逐渐减小，顶部的背散射光先增加后减小的趋势，根据背散射光光强随体系浓度的减小而减小，增大而增大的理论[15]，试验组和对照组样品均在底部出现澄清层，顶部出现脂肪上浮层，并且顶部脂肪上浮后颗粒之间发生了絮凝，使背散射光光强减小；图中的峰宽代表澄清层和脂肪上浮层的厚度[16]，可以看出在相同的条件下，试验组NaCN-glu的澄清层和脂肪上浮层厚度均小于对应的对照组NaCN样品；样品瓶中部的光强不重合，说明颗粒粒径变化明显，图6（b）的光强波动幅度更大，即粒径变化更大，乳状液更不稳定。由此可以证明酪蛋白酸钠经美拉德反应改性后的乳化性有明显的提高。

图6 不同DHA藻油乳状液Turbiscan扫描图谱

3 结论与讨论

美拉德反应可以改善蛋白质的功能特性。葡萄糖可以作为一种优良的糖基配体通过美拉德反应显著改善酪蛋白酸钠的乳化性。当酪蛋白酸钠的浓度为5%（W/W），酪蛋白酸钠与葡萄糖的质量比为1∶1（W/W），溶液起始反应pH为8.0时，酪蛋白酸钠-葡萄糖混合液经130 ℃热处理15 s得到的美拉德反应产物的乳化性能较好，与水浴90 ℃热处理90 min相当，是同等条件下酪蛋白酸钠的2倍，可作为新型乳化剂应用于DHA等功能因子输送体系的制备。此方法可实现连续化、高效率制备高乳化活性酪蛋白酸钠-葡萄糖美拉德反应产物，极大地缩短了热处理时间，对工业化生产具有指导意义。