EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌抑制作用的体外研究

薛静秀 李 涛 马 哲 任 建 马思雨 刘 娜

将天然植物提取物作为抑菌类漱口水的有效成分可以减少因使用化学制剂漱口水引起的一些副作用，如牙齿变色、口腔黏膜刺激症状、味觉减退等[1，2]。EGCG 是从茶叶中分离得到的儿茶素类单体，对变异链球菌具有一定的抑制作用[3，4]，但是EGCG单独作用时生物利用度相对较低，与其他物质配伍应用可提高其作用效率[5]。绿原酸是植物细胞通过莽草酸途径合成的一种苯丙素类物质[6]，其溶液口感醇和，刺激性小，对变异链球菌亦有一定的抑制作用，适用于开发抗龋漱口水产品[7]。本研究将二者配伍应用，测定不同浓度混合液对变异链球菌产酸、粘附及生物膜形成的影响，为其应用于龋病预防提供研究基础。

资料和方法

1.主要试剂及用品：EGCG（纯度96%）、绿原酸（纯度98%），洗必泰（购自深圳南粤药业有限公司），牛脑心浸出液培养基（brain heart infusion，BHI）（购自杭州微生物试剂有限公司），BHI 固体培养基（购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司），全波长酶标仪系统（Power Wave XS2，美国），台式 pH 计（Mettler Toledo，瑞士），激光共聚焦显微镜（Olympus，日本），国际标准菌株变异链球菌ATCC25175（购自广东省微生物研究所）。

2.菌液制备：将冻存菌株复苏，传代，鉴定，然后挑取2～3 个菌落接种于BHI 液体培养基，37℃恒温培养24h，离心，涂片，用生理盐水调节菌浓度为1.5×108CFU/ml。

3.实验药液的制备：EGCG 与绿原酸母液：将EGCG 与绿原酸溶解于无菌BHI 液体培养基中，配置浓度为1mg/ml EGCG 母液与20mg/ml 绿原酸母液，密封于4℃冰箱避光保存。

噻唑蓝溶液[3-（4，5-dimethyl-2thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide，MTT]：避光条件下称取0.15g MTT 溶于30ml PBS 缓冲液中，配制成浓度为5mg/ml 的储备液，现配现用。

吖啶橙（acridine orange，AO）、溴化乙锭（ethidium bromide，EB）荧光染液：避光条件下称取AO、EB 各 1mg，分别溶于 10ml pH 为 7.0 的 PBS 缓冲液中，无菌针头过滤器滤过除菌，4℃冰箱避光保存备用。染色前将AO、EB 储备液等比例混合后1：20 稀释成工作液。

4.确定EGCG、绿原酸的MIC 值：二倍稀释法将EGCG 母液稀释成如下浓度：1、0.5、0.25、0.125、0.063、0.031mg/ml，向96 孔板中每孔加入上述各浓度梯度 EGCG 药液190μl 和前述制备好的菌液10μl，此时菌浓度为 7.5×106CFU/ml，37℃恒温箱培养24h 后取出，在暗色背景下肉眼观察，最低浓度的孔中无菌生长者为其MIC 值。并设置阳性对照（190μl 洗必泰+BHI 液体培养基+10μl 菌液）、阴性对照（190μl BHI 液体培养基+10μl 菌液）、空白对照（200μl BHI 液体培养基），实验重复 3 次。

同法确定绿原酸的MIC 值。

5.确定EGCG、绿原酸的MBC 值：选取大于MIC的各浓度溶液，分别吸取10μl 接种于BHI 琼脂培养基平板上，37℃恒温培养24h，无细菌生长的最低浓度即为其MBC 值。

6.确定混合液的MIC 值：在96 孔板上横排分别加入浓度为 0.25、0.125、0.063、0.031、0.016、0.008mg/ml EGCG 溶液95μl，纵排分别加入等体积浓度为10、5、2.5、1.25、0.63、0.31mg/ml 绿原酸溶液，两溶液充分混匀后，每孔分别加入菌液10μl，于37℃恒温箱中培养24h，观察结果，并设置阳性对照、阴性对照、空白对照组，实验重复3 次。

7.联合用药效果评价：通过计算分级抑制浓度（FIC）指数来测定两者的抑菌关系。

FIC＝A 药联用时MIC/A 药单测时MIC+B 药联用时MIC/B 药单测时MIC

FIC≤0.5 时，两药为协同作用；0.5＜FIC≤1 时，两药为相加作用；1＜FIC＜2 时，两药为无关作用；FIC≥2 时，两药为拮抗作用。

8.EGCG-绿原酸对变异链球菌产酸能力的影响：选取联合用药实验中MIC 以内5 个浓度梯度（即 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC）混合药液做检测，用含1%蔗糖的BHI 培养基二倍稀释法配置以上5 个浓度混合药液，pH 计调定初始pH＝7.4，按菌液与药液1:20（体积分数）比例接种变异链球菌，于37℃恒温箱中培养24h 后，离心，pH 计测量上清液pH值，计算培养前后的△pH，并设置阴性对照，实验重复 4 次。

9.EGCG-绿原酸对变异链球菌24h 生物膜黏附作用的影响：将变异链球菌菌悬液接种于96 孔板中，37℃恒温培养24h，吸去孔板内BHI 培养基，分别加入上述5 个浓度的混合药液，恒温培养24h 后吸去孔板内溶液，PBS 漂洗两次，粘附于孔板底部的细菌用MTT 法定量测定，全自动酶标仪波长490nm检测吸光度（opticai density，OD）值，计算细菌抑制率，并设置阴性对照，实验重复4 次。抑制率＝（阴性对照组OD 值-实验组OD 值）/阴性对照组OD值×100%

10.激光共聚焦显微镜观察混合液对变异链球菌24h 生物膜作用的影响：在激光共聚焦小皿中加入变异链球菌菌液，37℃恒温培养24h，吸去液体培养基，分别加入前述5 个浓度混合药液，于37℃恒温箱中培养24h 后，吸去混合药液，PBS 漂洗两次，于避光暗室中滴加AO、EB 混合荧光染液200μl，孵育15min 后，PBS 漂洗去除多余染料。用放大倍数40×10（物镜×目镜）激光共聚焦显微镜（波长488/543nm）观察细菌生物膜。设置阳性对照、阴性对照，实验重复3 次。

11.统计学分析：实验结果采用SPSS 21.0 统计软件进行统计分析，数值用均数±标准差（）表示，各组间的数据比较用t检验，P＜0.05 为差异有统计学意义。

结 果

1.EGCG 和绿原酸的MIC 值: 二倍稀释法抑菌试验结果显示，EGCG、绿原酸MIC 值分别为0.125mg/ml和5mg/ml。

2.EGCG 和绿原酸的 MBC 值：EGCG、绿原酸的的MBC 值分别为0.5mg/ml（图1 的b）和 10mg/ml（图 1 的 A）。

图1 EGCG（b）和绿原酸（A）的最低杀菌浓度

3.EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌生长的影响：EGCG 和绿原酸联用时 MIC 值为0.063mg/ml EGCG+1.25mg/ml 绿原酸。根据公式计算得到二者联用时的FIC＝0.75，存在相加作用（表1）。

表1 不同浓度EGCG 和绿原酸联用对变异链球菌生长的影响

4.EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌产酸能力的影响：在 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC 各组的△pH值分别 2.465±0.0785、2.598±0.0263、2.683±0.0359、2.760±0.0294、2.835±0.0520（图 2）；各实验组与对照组相比，差异具有统计学意义（P＜0.05）。

图2 不同浓度EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌产酸的影响

5.EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌24h生物膜黏附作用的影响：选取 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC 5 个浓度的各组混合液，检测其对变异链球菌黏附于96 孔聚苯乙烯培养板上生物膜菌量的影响（厌氧孵育24h）。如表2 所示，随着药物浓度的增加生物膜的量（OD 值）逐渐减少，抑制率增加。各实验组与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

表2 EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌24h生物膜的粘附作用效果（）和抑制率

表2 EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌24h生物膜的粘附作用效果（）和抑制率

注：*:P＜0.05，vs control group; #：P＜0.05，vs 1/2MIC group.

浓度1/2MIC 1/4MIC 1/8MIC 1/16MIC 1/32MIC对照组images/BZ_12_2107_2709_2179_2766.png 0.494±0.017*0.604±0.015*#0.661±0.006*#0.787±0.034*#0.865±0.045*#1.331±0.030抑制率（%）62.87 54.66 50.34 40.85 34.99－

6. 激光共聚焦显微镜观察芦荟苷-绿原酸混合液对变异链球菌24h 生物膜作用的影响：CLSM 观察显示，1/32MIC 混合液的图像由于活菌数量大于死菌，绿色荧光强度高于红色荧光强度，同一视野叠加后呈绿色，细菌多呈块状或网状聚集（图3 的G），但是密集程度不及阴性对照组（图3 的A）。随着药液浓度的增加绿色荧光面积逐渐减少，红色荧光面积逐渐增加，同一视野叠加开始呈现黄绿色/黄色（图3 的E），细菌分布稀疏；浓度为1/2MIC 时，活菌量显著减少（图3 的C），而阳性对照组则显示极为分散的少量细菌（图3 的B）。

图3 EGCG-绿原酸混合液对变异链球菌24h 生物膜作用的结果（激光共聚焦扫描显微镜，绿色为活菌，红色为死菌 ×400）

讨 论

近年来越来越多的学者对茶叶提取物的开发与应用进行了大量研究，尤其是其中单体成分的作用，并且取得了一些理想结果。EGCG 是茶叶提取物中最有生物学活性的成分之一，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗炎等作用，在很多领域中进行了研究与应用。有学者将EGCG 应用于龋病预防与治疗的研究中，并报道一定浓度的EGCG 可以抑制变异链球菌生长、黏附及产酸[7]。在一项临床研究中发现，使用高浓度绿茶提取物溶液漱口可以明显降低学龄前儿童唾液中变异链球菌的数量[8]。本实验亦对EGCG 进行了变异链球菌体外抑菌研究，结果证明EGCG 对变异链球菌具有明确的抑制作用，0.125mg/ml 浓度EGCG 即可有效抑制变异链球菌的体外生长。

绿原酸又称3-咖啡酰宁酸，是植物金银花的主要功能性成分，具有抗菌、抗病毒、抗氧化、抗肿瘤等多种效用。有研究发现，绿原酸可抑制变异链球菌的GTF 活性，使其合成不溶性胞外多糖的能力降低，减少变异链球菌对蔗糖的分解与利用，从而减少牙菌斑生物膜的形成[9]。陈昱敏等对比了绿原酸溶液与氯己定漱口液对口腔内变异链球菌的抑制作用，发现应用一定浓度绿原酸溶液漱口可以起到与氯己定漱口液相似的抑菌效果，并且可以改善因长期使用氯己定化学制剂漱口液导致的味觉改变等症状[7]。众多研究发现，两种或多种药物配伍应用，不但可以达到单组分药物应用的抑菌作用，而且还可降低每种药物的使用剂量和副作用，本实验将EGCG 与绿原酸联合应用，检验其抑菌效果，并期望能够通过降低单种药物成分的使用浓度来减轻其应用时的副作用。实验结果显示，0.063mg/ml EGCG 与1.25mg/ml 绿原酸联合应用即可达到理想的MIC，二者之间可显示出相加作用。有学者研究发现抑菌试验中EGCG 与绿原酸均会对细菌细胞膜造成破坏作用[10，11]，以此来推测该混合物抑制变异链球菌的相加作用亦是因为二者对细菌细胞膜的破坏作用产生了相加作用。

EGCG-绿原酸混合液抑制变异链球菌产酸的机制可能与其抑制细菌GTF 活性，造成水不溶性胞外多糖的形成减少有关。本研究在蔗糖环境下观察了 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32MIC 共 5 个浓度梯度混合液对变异链球菌产酸的影响[12]，此外也研究了它们对变异链球菌粘附及生物膜形成的影响。我们发现发现随着配伍浓度的降低，变异链球菌的△pH 值及OD 值变化增加，表明二者配伍应用对变异链球菌产酸能力及粘附能力的抑制具有浓度相关性。有研究表明变异链球菌在生物膜状态下比在浮游状态下有更强的生存能力[13]，因此对防龋抗菌剂要求不仅要抑制变异链球菌浮游菌的生长还要有效减少其生物膜的形成。本实验中通过激光共聚焦显微镜观察发现EGCG 和绿原酸联合应用可影响变异链球菌生物膜的形成，不同浓度混合液可以不同程度地抑制生物膜中变异链球菌活性，混合液配伍浓度越高其抑菌能力越强。

本研究证明EGCG 和绿原酸联合应用可对变异链球菌的生长、产酸与粘附具有显著的抑制作用，而且二者配伍应用可降低单组分应用时的抑菌浓度，增强抑菌效果。但是本实验仅提供了体外抑菌的研究结果，并未进行体内实验及分子生物学机制方面的研究，EGCG 和绿原酸混合液的抑菌机制尚需进一步的研究探讨。